培養(yǎng)基母液配制中的若干關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1、培養(yǎng)基母液配制中的若干關(guān)鍵環(huán)節(jié)培養(yǎng)基母液,也叫濃縮貯備液.它是以培養(yǎng)基配方配制成的高倍的濃縮液,不同組分母液,它的濃縮倍數(shù)不同,一般最低為10倍,高的有50倍、100倍、200倍,甚至1000倍.母液是一個方法比較簡便、用量比較準(zhǔn)確且被廣泛采用的配制方法.本文就如何掌握培養(yǎng)基母液配制的操作要領(lǐng)作一闡述,以供參考.以MS培養(yǎng)基為例,其母液的配制包括大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素、氨基酸、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機附加物等種類.（見表1）大量元素和微量元素母液的配制按規(guī)定用量,稱取所需的各種藥品,在配制時為減少工作量,可以把幾種藥品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（見表1）.但由于各種藥品的混

2、合,可能發(fā)生反應(yīng),生成沉淀物,以致母液失效.為避免類似現(xiàn)象發(fā)生,在大量元素、微量元素和維生素及氨基酸的母液配制時，可采用如下2種做法加以解決：將要配在同一母液的大量元素、微量元素和維生素及氨基酸等化合物,按“表1”所列藥品的先后順序溶解藥品,待前一種藥品完全溶解后再加入后一種化學(xué)藥品，以此類推；使每種成份分別完全溶解,再把它們彼此混合.鐵鹽母液的配制鐵鹽的成份含硫酸亞鐵（FeSO4-7H2O）和乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）.這兩種化合物的溶解和混合較為嚴(yán)格,必須按如下方法配制,否則將會產(chǎn)生沉淀.該方法是：分別溶解FeSO4-7H2O和Na2-EDTA,加熱并不斷攪拌,使之完全溶解,冷卻

3、，將2種溶液混合,調(diào)PH至5.5,用蒸溜水加至所需容積,棕色瓶保存于冰箱之中.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基的重要組分之一,一般是植物激素類物質(zhì),如生長素類的IAA、IBA、NAA,赤霉素類的GA3,細(xì)胞分裂素類的2,4-D、KT和6-BA等.由于大多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水,因此配制方法也各不相同：IAA,IBA和GA3先用少量95%酒精溶解,再加水定容，搖勻后貯于試劑瓶中、貼上標(biāo)簽后，存放在冰箱中；NAA可用熱水或少量95%酒精溶解,再加水定容至所需容積；2,4-D可溶于少許0.1mol-L-1的NaOH溶液中,然后加水定容；KT和6-BA可用少量0.1molL-1的HC

4、l溶解,再加水定容；玉米素先溶于少量95%酒精中,然后加水定容.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度通常用ppm（mgml-1）和molL-1表示,在配制母液時，常以ppm較為方便,一般配制成0.5ppm的母液,這個濃度既便于計算,也可避免冷藏時形成結(jié)晶.4有機附加物母液的配制在植物組織培養(yǎng)時,培養(yǎng)基中往往要加入一些有機附加物,如椰子汁,以促進組織培養(yǎng)活性.由于椰子汁的活性成分是耐熱的,在配制時,要先把由果實中采集到的汁液加熱煮沸以除去其中的蛋白質(zhì),過濾,然后置塑料瓶中貯存于的-20的低溫冰箱內(nèi).MS培養(yǎng)基配制中的五點注意母液配制必須嚴(yán)格分類配制高濃度的母液是植物組織培養(yǎng)的基本功。配制母液的目的，除了多次取用

5、、節(jié)省實驗準(zhǔn)備的時間外，還有抑制雜菌生長的作用。高濃度的母液能夠有效地抑制細(xì)菌與霉菌的生長，加上低溫環(huán)境(4)，能夠大大增加培養(yǎng)基的存放時間(一年左右)。一般而言，培養(yǎng)基中的各個成分可以按照表1的分類方式配成母液?？傤悇e母液倍數(shù)分類別成分一旦二主大量元素10-25倍大量元素-1NH4NO3,KNO3,KH2PO4大量元素-2CaCl2大量元素-3MgSO4微量元素20-50倍微量元素-1MnSO4,ZnSO4,CuSO4微量元素-2H3BO3,Na2MoO4,.CoCl2微量元素-3KI鐵鹽10-25倍鐵鹽EDTA-Na2,FeSO4有機附加物10-25倍甘氨酸甘氨酸煙酸煙酸肌醇肌醇維生素B1

6、維生素B1維生素B6維生素B6注：“母液倍數(shù)”為筆者建議，具體濃度應(yīng)以具體用量為準(zhǔn)。按照表1的要求，每一個“分類別”為一瓶母液，按照相應(yīng)的成分配制好后，4避光保存，用時按照母液倍數(shù)進行稀釋即可。母液分類的依據(jù)，是要避免MS培養(yǎng)基中某些成分發(fā)生沉淀反應(yīng)。例如，如果將全部的大量元素混合在一起配制，則KH2PO4和CaCl2易產(chǎn)生Ca3（PO4）2沉淀，而CaC1jDMgSO4將生成CaSO4沉淀。除上述成分外，還必須加上蔗糖、瓊脂以及激素，才構(gòu)成用于組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基。激素的溶解方法MS培養(yǎng)基中常用的激素，如2,4-D、NAA、6-BA,也要配制成1020倍母液，這樣便于稱量（激素的用量極小，給

7、稱量造成不便），且可以多次取用。激素的配制與一般的藥品不同，需要助溶劑。如要配制10mL的1mg/mL2,4-D母液，則應(yīng)稱取0.01g2,4-D固體，置于小燒杯中，再以13mL的95%乙醇（或0.1mol/LNaOH）溶解，最后緩慢加入蒸餾水定容。即每加入1mL蒸餾水，立即攪拌均勻，使白色沉淀消失。重復(fù)數(shù)次,直至定容。一般而言，生長素類物質(zhì)2,4-D、NAA）要用95%乙醇（或0.1mol/LNaOH）助溶，而細(xì)胞分裂素類物質(zhì)（如6-BA）要用0.1mol/L的HC1助溶。助溶劑的用量一定要小,不能因其溶解效果好而過量使用,否則將影響培養(yǎng)基的質(zhì)量（改變培養(yǎng)基成分或pH值）。配制好的激素要常溫

8、避光保存，盡快使用（盡量不超過一個月）。將激素母液保存在4冰箱中,希望獲得較長的保存時間。但事實上這種做法是不可取的,因為激素在低溫環(huán)境中易析出沉淀,影響使用效果。危險藥品的使用與保管盡管組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟,也很普及,但該技術(shù)并不安全。除注意滅菌鍋、超凈臺等大型儀器的使用安全外,最重要的當(dāng)屬危險藥品的使用與保管。原則上，MS培養(yǎng)基中任何一種藥品都有一定的危險性?，F(xiàn)只把最突出、最需要預(yù)防的藥品注釋如下。（1）NH4NO3、KNO3此兩種藥品為易爆品，取用時一定要輕拿輕放，保存在陰涼處。另外，目前NH4NO3,的購買受到一定的限制，也可以考慮使用其他培養(yǎng)基，如N6或B5培養(yǎng)基，無NH4NO3

9、成分，亦為組織培養(yǎng)所常用。EDTA-Na2、CoC12、2，4-D此三種藥品為致癌物，配制時要帶膠皮手套，或兩層塑料手套。EDTA-Na為金屬螯合劑，有一定的粘性；CoCl2能夠?qū)е禄蛲蛔?，遺傳學(xué)實驗中也常用其作為致突變劑；2,4-D是高效農(nóng)藥，對人的皮膚有傷害作用。熱水定容原則在母液、激素、蔗糖、瓊脂都加入后，很多人習(xí)慣用微波爐或電磁爐加熱溶解培養(yǎng)基（特別是瓊脂）。培養(yǎng)基熔化后，由于水分的蒸發(fā)，會造成體積的減少，從而需要定容。這時一定要用熱水（60左右）進行定容，切忌用冷水（30以下），否則培養(yǎng)基中局部的瓊脂將凝固，造成營養(yǎng)成分濃度不均。關(guān)于調(diào)節(jié)pH適合的pH保證了營養(yǎng)成分的正常發(fā)揮，也決

10、定了培養(yǎng)基的硬度（偏酸則過軟，偏堿則過硬，都不利于組織的生長），故要十分留意。對于MS培養(yǎng)基而言，只要各個成分按照用量精確加入，并且在熔化培養(yǎng)基時加熱時間適合（平均100mL培養(yǎng)基加熱6090s，保證完全熔化的同時，盡量限制加熱時間），則培養(yǎng)基的pH自然地將處于最適范圍內(nèi)。調(diào)解pH時最好用電子pH計，以保證精確度。pH試紙的誤差較大，要小心調(diào)節(jié)?？梢詫H調(diào)到比最適值小一些，因為培養(yǎng)基在滅菌后，pH將變大。電子天平操作規(guī)程1開機檢查天平電線是否連接好電源。檢查天平水平儀中的空氣泡是否在內(nèi)圈中部，若不在則調(diào)節(jié)天平后座腳螺絲使其在正中。查看天平室內(nèi)干燥劑是否變色，若變色，換活化后的干燥劑。打開電源

11、，按on/off鍵，開啟天平，預(yù)熱120分鐘。一般稱重待天平穩(wěn)定后，出現(xiàn)0.00000g，長按t鍵，轉(zhuǎn)換所需的稱量單位。將容器放置稱盤正中央，待g出現(xiàn)后，即為容器的重量。按t鍵去皮，將天平顯示置歸零。置入欲稱的樣品，待g出現(xiàn)后，即是樣品的重量。重復(fù)2.22.5稱取其它物品。稱量完畢，按on/off鍵關(guān)機。天平校正選擇校正模式首次接通電源，待天平預(yù)熱120分鐘后，開機，立即按住menu鍵不放，2秒后，出現(xiàn)setconfiguration,再放開menu鍵，按J鍵3次，直到出現(xiàn)setcalibration后，按回車鍵，選擇校正模式：external（外砝碼校正）internal（內(nèi)砝碼校正）。內(nèi)砝

12、碼校正移走稱盤上所有東西，按住t鍵不放，直到出現(xiàn)calibration再放手，天平開始閃爍，約過十幾秒，天平停止閃爍，校正完畢。外砝碼校正移走稱盤上所有東西，按住t鍵不放，直到出現(xiàn)calibration再放手，0點開始閃爍，之后出現(xiàn)一100,置入100g標(biāo)準(zhǔn)砝碼，約過十幾秒，天平停止閃爍，移走砝碼，校正完畢。注意事項天平應(yīng)放置在無振動位置，盡可能的水平，稱量時也應(yīng)輕拿輕放。不能稱取超出最大稱量范圍（205g）的物品。稱量完畢，卸下載物，用軟毛刷做好清潔工作，并關(guān)閉天平門蓋。天平每次放置新位置時，應(yīng)該調(diào)節(jié)水平。維護方法避免陽光直射。平時天平室內(nèi)應(yīng)放置活化好的干燥劑，保持天平室內(nèi)的干燥。請不要用包

13、含溶劑或研磨劑的清潔劑，其將導(dǎo)致操作平臺的薄膜損壞。請注意勿讓液體滲透進天平。使用者請不要維修，保養(yǎng)與替換天平的任何部件。容量瓶的使用方法及注意事項容量瓶主要用于準(zhǔn)確地配制一定摩爾濃度的溶液。它是一種細(xì)長頸、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞。瓶頸上刻有標(biāo)線，當(dāng)瓶內(nèi)液體在所指定溫度下達(dá)到標(biāo)線處時，其體積即為瓶上所注明的容積數(shù)。容量瓶的容積比量筒準(zhǔn)確，用于配制一定體積、一定物質(zhì)的量濃度的溶液。容量瓶不能配制其容積以下體積的溶液，即其容積為多大，就只能配制多大體積的溶液。常用的容量瓶有100、250、500、1000毫升等多種規(guī)格。使用容量瓶配制溶液的方法是：(1)使用前檢查瓶塞處是否漏水。具體操作方法

14、是：在容量瓶內(nèi)裝入半瓶水，塞緊瓶塞，用右手食指頂住瓶塞，另一只手五指托住容量瓶底，將其倒立(瓶口朝下)，觀察容量瓶是否漏水。若不漏水，將瓶正立且將瓶塞旋轉(zhuǎn)180后，再次倒立，檢查是否漏水，若兩次操作，容量瓶瓶塞周圍皆無水漏出，即表明容量瓶不漏水。經(jīng)檢查不漏水的容量瓶才能使用。(2)把準(zhǔn)確稱量好的固體溶質(zhì)放在燒杯中，用少量溶劑溶解。然后把溶液轉(zhuǎn)移到容量瓶里。為保證溶質(zhì)能全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，要用溶劑多次洗滌燒杯，并把洗滌溶液全部轉(zhuǎn)移到容量瓶里。轉(zhuǎn)移時要用玻璃棒引流。方法是將玻璃棒一端靠在容量瓶頸內(nèi)壁上，注意不要讓玻璃棒其它部位觸及容量瓶口，防止液體流到容量瓶外壁上(3)向容量瓶內(nèi)加入的液體液面離標(biāo)

15、線1厘米左右時，應(yīng)改用滴管小心滴加，最后使液體的彎月面與標(biāo)線正好相切。若加水超過刻度線，則需重新配制。(4)蓋緊瓶塞，用倒轉(zhuǎn)和搖動的方法使瓶內(nèi)的液體混合均勻。靜置后如果發(fā)現(xiàn)液面低于刻度線，這是因為容量瓶內(nèi)極少量溶液在瓶頸處潤濕所損耗，所以并不影響所配制溶液的濃度，故不要在瓶內(nèi)添水，否則，將使所配制的溶液濃度降低。使用容量瓶時應(yīng)注意以下幾點：(1)容量瓶的容積是特定的，刻度不連續(xù)，所以一種型號的容量瓶只能配制同一體積的溶液。在配制溶液前，先要弄清楚需要配制的溶液的體積，然后再選用相同規(guī)格的容量瓶。(2)不能在容量瓶里進行溶質(zhì)的溶解，應(yīng)將溶質(zhì)在燒杯中溶解后轉(zhuǎn)移到容量瓶里。(3)用于洗滌燒杯的溶劑總

16、量不能超過容量瓶的標(biāo)線。(4)容量瓶不能進行加熱。如果溶質(zhì)在溶解過程中放熱，要待溶液冷卻后再進行轉(zhuǎn)移，因為一般的容量瓶是在20的溫度下標(biāo)定的，若將溫度較高或較低的溶液注入容量瓶，容量瓶則會熱脹冷縮，所量體積就會不準(zhǔn)確，導(dǎo)致所配制的溶液濃度不準(zhǔn)確。(5)容量瓶只能用于配制溶液，不能儲存溶液，因為溶液可能會對瓶體進行腐蝕，從而使容量瓶的精度受到影響。(6)容量瓶用畢應(yīng)及時洗滌干凈，塞上瓶塞，并在塞子與瓶口之間夾一條紙條，防止瓶塞與瓶口粘連。移液管的使用移液管是一種量出式儀器，只用來測量它所放出溶液的體積。它是一根中間有一膨大部分的細(xì)長玻璃管。其下端為尖嘴狀，上端管頸處刻有一條標(biāo)線，是所移取的準(zhǔn)確體

17、積的標(biāo)志。常用的移液管有5,10，25,和50mL等規(guī)格。通常又把具有刻度的直形玻璃管稱為吸量管。常用的吸量管有1,2,5,和10mL等規(guī)格。移液管和吸量管所移取的體積通?？蓽?zhǔn)確到0.01mL。.使用前：使用移液管，首先要看一下移液管標(biāo)記、準(zhǔn)確度等級、刻度標(biāo)線位置等。使用移液管前，應(yīng)先用鉻酸洗液潤洗，以除去管內(nèi)壁的油污。然后用自來水沖洗殘留的洗液，再用蒸餾水洗凈。洗凈后的移液管內(nèi)壁應(yīng)不掛水珠。移取溶液前，應(yīng)先用濾紙將移液管末端內(nèi)外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2至3次，以確保所移取溶液的濃度不變。.吸液：用右手的拇指和中指捏住移液管的上端，將管的下口插入欲吸取的溶液中，插入不要太淺或太深

18、，一般為1020mm處，太淺會產(chǎn)生吸空，把溶液吸到洗耳球內(nèi)弄臟溶液，太深又會在管外沾附溶液過多。左手拿洗耳球，先把球中空氣壓出，再將球的尖嘴接在移液管上口，慢慢松開壓扁的洗耳球使溶液吸入管內(nèi)，先吸入該管容量的1/3左右，用右手的食指按住管口，取出，橫持，并轉(zhuǎn)動管子使溶液接觸到刻度以上部位，以置換內(nèi)壁的水分，然后將溶液從管的下口放出并棄去，如此用反復(fù)洗3次后，即可吸取溶液至刻度以上，立即用右手的食指按住管口。.調(diào)節(jié)液面：將移液管向上提升離開液面，管的末端仍靠在盛溶液器皿的內(nèi)壁上，管身保持直立，略為放松食指(有時可微微轉(zhuǎn)動吸管)使管內(nèi)溶液慢慢從下口流出，直至溶液的彎月面底部與標(biāo)線相切為止，立即用食指壓緊管口。將尖端的液滴靠壁去掉，移出移液管，插入承接溶液的器皿中。.放出溶液：承接溶液的器皿如是錐形瓶，應(yīng)使錐形瓶傾斜30,移液管直立，管下端緊靠錐形瓶內(nèi)壁，稍松開食指，讓溶液沿瓶壁慢慢流下，全部溶液流完后需等15s后再拿出移液管，以便使附著在管壁的部分溶液得以流出。如果移液管未標(biāo)明“吹”字，則殘留在管尖末端內(nèi)的溶液不可吹出，因為移液管所標(biāo)定的量出容積中并未包括這部分殘留溶液。備注：.移液管提出液面后，應(yīng)用濾紙將沾在移液管外壁的液體擦掉；.看刻度時，應(yīng)將移液管的刻度與眼睛平行，以最下面的彎月面為準(zhǔn)。附：移液管的正確使用，吹與不吹。移液管，刻度吸管是實驗室常