實驗八親和層析分離純化蛋白質(zhì)

1、關(guān)于實驗八親和層析分離純化蛋白質(zhì)第1頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 實驗目的掌握GST親和層析分離純化目標蛋白的原理和實驗方法（第一部分）掌握SDS檢測目標蛋白原理和方法（第二部分）第2頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三第一部分 GST親和層析分離純化目標蛋白第3頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 一、實驗原理第4頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三親和層析 生物大分子與配體特異非共價可逆結(jié)合。酶-底物或底物類似物抗體-抗原激素-受體外源凝集素-多糖、糖蛋白、細胞表面受體核酸-互補核苷酸序列（Ol

2、igo-dT）第5頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三親和層析原理第6頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三GST親合層析 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST，26kd，與谷胱甘肽GSH特異結(jié)合）GSH作為配體，共價結(jié)合在葡聚糖上，（Sepharose 4B）GST融合目標蛋白葡聚糖上的GSH與GST融合蛋白結(jié)合用還原型GSH洗脫GST融合蛋白第7頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三GSH- Sepharose 4B第8頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三GSH- Sepharose 4B第9頁，共34頁，2022年，

3、5月20日，22點11分，星期三第10頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三第11頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三外源蛋白的表達和純化第12頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 二、實驗步驟第13頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三第14頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 （一）目標蛋白誘導表達和菌體收集 10.5 mmol/L IPTG誘導大腸桿菌中的蛋白表達，28，200 rpm培養(yǎng)3-6 h。25000 rpm離心5 min，倒掉上清。3沉淀加40 ml水，5000 rpm離

4、心5 min。第15頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三（二）細胞破碎1倒掉上清，加30 ml PBS緩沖液懸浮菌體。2破碎菌體，超聲波2 min，停止1 min。 （菌液始終保持在冰浴中）3重復8-10遍，直至菌液清澈。第16頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三（三）離心1每個小組分取1-2 ml細胞破碎液， 12000 rpm，離心5 min。2分取50 uL上清液，4保存。3其余的上清液準備過GST柱子。第17頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三（四）裝GST柱子1清洗和裝好層析柱，封閉出口。2加入2 mL PBS。3用滴

5、管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。4打開柱子出口，使PBS緩慢流出。注意：始終保持柱內(nèi)的液面高于GST樹脂。第18頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三（五）純化目的蛋白1用5 ml PBS緩沖液洗柱床，重復3遍。2將混合蛋白質(zhì)溶液加到柱子中。3用5 ml PBS緩沖液洗柱子，重復3遍。4加入1ml 洗脫液。第19頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三5用離心管收集洗脫液，每管收集0.2ml。6PBS 緩沖液洗柱子3遍，關(guān)閉出口。7用分光光度計測定每一管的吸光度值， 記錄讀數(shù)，繪制洗脫曲線。8將讀數(shù)最大的一管用于SDS分析。第20頁，共34頁

6、，2022年，5月20日，22點11分，星期三第二部分SDS檢測目標蛋白第21頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 一、實驗原理第22頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成復合物，消除了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決于分子大小。在15-200 KD之間，遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：log MW = K - bm第23頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三第24頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三濃縮膠濃縮膠pH6.8，Gly pI6.0，三類離子在電場中的遷

7、移速度：Cl-蛋白質(zhì)Gly-。電泳時，Cl-快，Gly-慢，在快慢離子間形成了一個低離子濃度的高壓區(qū)，區(qū)內(nèi)的蛋白質(zhì)加速移動。當?shù)鞍踪|(zhì)移到Cl-區(qū)時，高電壓消失，蛋白質(zhì)的移動速度減慢，在快慢離子間被濃縮。第25頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三二、實驗步驟1洗凈玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈后吹干，安裝制膠器。2根據(jù)下列配方制作12%分離膠。 第26頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三12%分離膠試劑名稱12%分離膠蒸餾水2.5 ml30% 丙烯酰胺（29:1）3.0 ml1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 ml10% SDS75 ul四甲基乙

8、二銨（TEMED）10 ul10% 過硫酸銨（AP）75 ul總體積7.5 ml第27頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三按上表中所列順序加試劑，加完AP后輕輕搖勻，迅速加入兩塊玻璃板間。在分離膠液面上緩慢滴加1 mL蒸餾水，聚合15 min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。第28頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三試劑名稱5.0%蒸餾水1.7 ml30%丙烯酰胺（29:1）430 ul1M Tris-HCl（pH6.8）310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二銨（TEMED）10 ul10%過硫酸銨（AP）

9、25 ul總體積2.5 ml3制作5.0%濃縮膠 按照下表配好濃縮膠，輕輕混勻，灌膠2ml，插入梳子，聚合15 min。第29頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三4把膠板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，拔掉梳子，電極緩沖液應該完全沒過電極。5每個點樣孔加30ul樣品，每板膠加10ul Marker。650V電泳20min，等蛋白進入分離膠后，將電壓調(diào)節(jié)到80V，電泳2-3h。7等到溴酚藍接近膠底部時，關(guān)閉電源。第30頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三8撬開玻璃板，將凝膠放在塑料盒內(nèi)， 加入染色液，染色30min。9染色后的凝膠用蒸餾水漂洗，用脫色液脫色。（或用蒸餾水加熱脫色）第31頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三pGEX-4T-3 纖維素酶的純化非誘導誘導純化1 純化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28 ，200rpm，6h第32頁，共34頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三SDS樣品制備 1號樣，過親和層