實(shí)驗(yàn)四蛋白酶活力的測定

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)四蛋白酶活力的測定第1頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆斩繙y定蛋白酶活性的方法，了解本實(shí)驗(yàn)的酶、底物和生成物的相關(guān)性，以及本反應(yīng)的環(huán)境條件。進(jìn)一步理解酶活力和比活力的概念鞏固比色法測定物質(zhì)含量的基礎(chǔ)，掌握分光光度計(jì)使用方法，學(xué)習(xí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法第2頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理1胰蛋白酶是一種水解酶，將酪蛋白水解成酪氨酸等物質(zhì)。2所生成的酪氨酸能與酚試劑反應(yīng)成藍(lán)色物質(zhì)。酚試劑又名Folin試劑，是磷鎢酸和磷鉬酸的混合物，在堿性條件下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物還原產(chǎn)生藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物，680nm）。3用

2、分光光度計(jì)可以定量比較顏色深淺，測定酪氨酸生成量，根據(jù)生成物的含量可以計(jì)算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。4. 蛋白酶活力單位定義：在40C，pH7.5的條件下，反應(yīng)10min，以每min水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸為1U。第3頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三三、器材儀器和主要試劑 可見光分光光度計(jì) 水浴鍋Folin 酚試劑 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶第4頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三四、實(shí)驗(yàn)操作1、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號123456樣品、對照濾液（各2支試管）100g/ml

3、 Tyr (ml)00.20.40.60.81.0每支管加1ml水（ml)1.00.80.60.40.20稀釋后Tyr濃度（g/ml）020406080100Na2CO3 (ml)5555555Folin-酚試劑 (ml)1111111迅速混合，于40放置15分鐘 A680nm調(diào)0 A樣、A對照以酪氨酸的濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)， A680nm為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 管號酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40水浴保溫10分鐘，過濾得濾液 樣品管12-3-對照管1-3-2第5頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三2

4、、蛋白酶活力的測定按下表操作，然后測定濾液中的酪氨酸含量。濾液各取1ml，進(jìn)行顯色反應(yīng)(加Na2CO35ml+Folin-酚試劑1ml，40 C保溫15min)以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的1號管調(diào)0，測定A 樣 (樣品液A680nm值)和A 對 (對照液A680nm值)；管號酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40水浴準(zhǔn)確保溫10分鐘三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40水浴保溫10分鐘，過濾得濾液。 1 號(樣品)12-3-2 號(對照)1-3-2第6頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三3. 酶活力計(jì)算胰酶活力定義： 40 ， pH7.5 ，反應(yīng)10min，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸

5、 1 微克為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算：1g 蛋白酶所具備的總活力單位為： ( A 樣 - A 對) K V/t N A 樣 ：樣品液光吸收值； A 對 ：對照液光吸收值； K ：標(biāo)準(zhǔn)曲線上A680nm為 1 時(shí)的酪氨酸微克數(shù)； t ：酶促反應(yīng)的時(shí)間（min），本實(shí)驗(yàn) t =10min ； V ：酶促反應(yīng)管的總體積（ml數(shù)），本實(shí)驗(yàn) V =6 ； N ：本次實(shí)驗(yàn)酶液的稀釋倍數(shù):6000第7頁，共9頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三五、思考題酶的試驗(yàn)為何設(shè)對照又要設(shè)空白?稀釋的酶溶液是否可長期使用？說明原因。計(jì)算公式中的v=6該如何理解本實(shí)驗(yàn)用什么方法終止酶促反應(yīng)?還有其他方法可以終止反應(yīng)嗎?如何保證本實(shí)驗(yàn)測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性？