烏司他丁對控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase―3表達(dá)及凋亡程度

1、烏司他丁對控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase 3表達(dá)及凋亡程度【摘要】目的：觀察烏司他丁對控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷Caspase-3表達(dá)及凋亡程度。方法：60 只新西蘭大白兔隨機(jī)分成5 組，每組 12 只：正常組（組） ，控制性降壓組（組，平均動脈壓降至基礎(chǔ)值的 45%組），烏司他丁降壓前給藥組（組，控制性降壓前 30min 靜注烏司他丁 10*104IU/kg ），烏司他丁降壓后給藥組（組，控制性降壓開始后 30min 靜注烏司他丁 10*104IU/kg ），烏司他丁降壓前 +降壓后給藥組（組，控制性降壓開始前 30min 和開始后 30min 均靜注烏司他丁 10*104

2、IU/kg ）。各組在硝普鈉降壓一個小時后， 停止降壓 2 小時后處死，取出海馬組織。 TUNEL 檢測海馬凋亡細(xì)胞， 用 Western-blot 檢測海馬組織 casspase-3。結(jié)果： 1、Western-blot 檢測：與 II 組比較， 三組用藥組 （ III、IV、V 組） Caspase-3表達(dá)顯著減少（ P0.01）；與 III、IV 組比較， V 組 Caspase-3表達(dá)減少（ P0.05）。與 II 組比較，用藥三組調(diào)亡指數(shù)減少（ P0.01）。2、 TUNEL檢測：與 II 組、 III 組、 IV 組、 V 組比較，顯示 I 組調(diào)亡指數(shù)最少的（ P0.01）。與 I

3、II 組、V 組比較，顯示 IV 組的調(diào)亡指數(shù)有所增加 （ P0.05）。結(jié)論： 1、烏司他丁對控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護(hù)作用，其可能抑制 Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)； 2、在三組給藥的不同時段比較中，降壓前 +降壓后給藥組（ V 組） Caspase-3的表達(dá)最少；由此說明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時給藥?！娟P(guān)鍵詞】 烏司他?。?控制性降壓；缺血缺氧腦損傷；casspase-3【中圖分類號】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1671-8801（ 2016） 02-0014-02控制性降壓是在手術(shù)中常用的技術(shù)。同時控制性降壓也會帶來風(fēng)險，有學(xué)者報導(dǎo)在控

4、制性降壓出現(xiàn)腦損傷等1-2 。關(guān)于不同的控制性降壓水平對兔海馬CA1神經(jīng)元影響的研究結(jié)果顯示 MAP 降至基礎(chǔ)值的 45%，兔海馬 CA1 神經(jīng)元凋亡程度最嚴(yán)重， 因此本研究以 MAP 降至基礎(chǔ)值 45%，以觀察烏司他丁對控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧腦損傷 Caspase-3表達(dá)及凋亡程度以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。1 資料與方法1.1 實驗材料實驗動物 清潔級新西蘭雄性大白兔，體重 1.8-2.2kg。實驗藥物及試劑 烏司他丁、 TUNEL試劑盒、 Caspase-3。 1.2 實驗方法分組及給藥方法 健康新西蘭白兔 60 只，雄性，體重1.8-2.2Kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。60 只健康新西蘭

5、白兔，隨機(jī)分成5 組，每組 12 只：正常組（ I 組），控制性降壓組（ II 組，平均動脈壓 MAP 降至基礎(chǔ)值的45%組），烏司他丁降壓前用藥組（ III 組，控制性降壓前 30min 靜脈注射烏司他丁 10*104U/kg ），烏司他丁降壓后用藥組（ IV 組，控制性降壓開始后 30min 靜脈注射烏司他丁 10*104U/kg ），烏司他丁降壓前 +降壓后用藥組（ V 組，控制性降壓開始前30min 和開始后30min 均給予靜脈注射烏司他丁10*104U/kg ）。動物模型氯胺酮 50 mg/kg 復(fù)合 1mg/kg 力月西肌注麻醉（術(shù)中肌注氯胺酮20 mg/kg/30min ）。沿

6、頸中正切開，分離氣管，插入氣管導(dǎo)管，接呼吸機(jī)機(jī)械通氣（潮氣量21ml ，呼吸 51bpm ， FiO21.0）。分離頸內(nèi)靜脈、穿刺置管，接延長管輸液通路并輸液 （ 8ml/kg ）。在兔腹股溝下緣分離股動脈并穿刺置管，接測壓轉(zhuǎn)換器并開始動脈測壓。正常組采用5%葡萄糖注射液 4ml/ （ kg*h ） 連續(xù)泵注；降壓組及治療組均采用 5%葡萄糖液配制的硝普鈉 （ 400ug/ml ）開始泵注， 10-15 分鐘內(nèi)降至目標(biāo)血壓， 維持目標(biāo)血壓 l h。根據(jù)上述分組方案，給予烏司他丁。降壓完畢后，實驗動物復(fù)壓2 h 后處死。1.3 標(biāo)本采集與處理每組動物中的一半用于灌注固定：降壓停止后 2h，打開胸

7、腔暴露心臟， 由心尖進(jìn)針插入升主動脈（同時鉗夾腹主動脈，剪開右心耳） ，快速滴注 37生理鹽水 500ml ，無血污后改為滴注 4%多聚甲醛固定液 500mL，先在 5min 內(nèi)灌入約100ml ，余液在25 分鐘內(nèi)灌完。開顱取出 1mm 及 4mm 海馬組織，切取右邊1mm3 置于 4%多聚甲醛液中后固定，剩余組織放置于中性甲醛溶液中固定、梯度乙醇脫水、包埋、切片、撈片、烤片。每組中另外一半動物在復(fù)壓 2h 后處死，迅速取出海馬組織，在-80凍存，用于Western Blot 檢測。1.4 標(biāo)本檢測方法檢測 Caspase-3的表達(dá)剪碎組織，與裂解液1： 5 混合，取上均漿。離心，取上清液；

8、使用 Bradford 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量， 然后 12%SDS電泳分離，依 marker 指示，將測蛋白轉(zhuǎn) PVDF膜上；封閉液4過夜，抗Caspase-3 抗體 1： 1500 稀釋與 PVDF膜溫 2H，加入二抗， ECL反應(yīng) 2min ，將蛋白印跡曝光在X 光膠片上。結(jié)果使用 Gel-Pro Analyzet4.0 進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參。檢測凋亡細(xì)胞將冰凍組織切片固定 10min ， PBS 漂洗 10*2min 。再置乙醇：乙酸（ 2：1）溶液 -20處理 5min 。PBS 漂洗 10*2min 。 2% H2O2浸泡 5min 。PBS洗滌 10*2min 。滴加 TdT

9、酶反應(yīng)液，37孵育 1h（陰性染色對照， 加不含 TdT 酶的緩沖液替代） 。滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的地高辛抗體，室溫孵育 30min 。PBS洗滌 10*2min 。DAB 顯色 36min 。蒸餾水洗 5*3min 。甲基綠復(fù)染 10min 。蒸餾水洗 5*3min ，再用 100%正丁醇5*3min 。常規(guī)脫水、透明和封片。在 400 倍光鏡下觀察海馬組織病理學(xué)改變。隨機(jī)選取 6 個視野，按照（ TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞 / 神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)） 100%計算海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡指數(shù)。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行分析。 所有計量資料進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析

10、，P0.05，認(rèn)為有差異統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果2.1 Western-blot 檢測 Caspase-3的表達(dá)與控制性降壓組（ II 組）比較，三組用藥組（ III、IV、 V 組）Caspase-3含量顯著減少 （ P0.01）；V 組與 III、IV 比較，顯示 V 組 Caspase-3含量減少（ P0.05）。結(jié)果如下圖：2.2 TUNEL檢測凋亡細(xì)胞與 II 組比較， III、IV、V 組三組調(diào)亡指數(shù)減少（ P0.01）。II、III、IV、V 組與 I 組比較， P0.01，顯示正常組調(diào)亡指數(shù)最少的。 IV 組與 III、V 組比較， P0.05，顯示 IV 組，調(diào)亡指數(shù)有所增加。討論腦

11、血流有自動調(diào)節(jié)功能，但是這種自我調(diào)控功能和耐受性的平均動脈壓的安全低限存在明顯的個體差異。同時腦的生理特性也是腦缺血缺氧易損傷的原因之一。當(dāng)控制性降壓引腦灌注壓明顯下降時，極易使腦缺血缺氧而受到損害4-5 。腦缺血缺氧會引起促進(jìn)細(xì)胞凋亡6 。參與凋亡過程相關(guān)的基因有幾十種， 其研究較多的如Bcl-2 家族 7 、即早基因 8 、caspase 家族 9 等。其中， Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是 CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中， Caspase-3是最為主要的， 在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中起著決定性作用 10 。本實驗中，Western blot 檢

12、測 Caspase-3顯示給藥三組（III組、IV 組及 V 組）與控制性降壓組比較， 三組用藥組 Caspase-3 的含量顯著減少，說明用藥后， Caspase-3的表達(dá)是減少的，減輕了神經(jīng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)。烏司他丁降壓前 +降壓后用藥組Caspase-3的表達(dá)，明顯少量其它用藥二組， 說明 V 組烏司他丁的用藥方法更好的抑制 Caspase-3的表達(dá)，減輕了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。同時在凋亡指數(shù)中正常組的神經(jīng)海馬細(xì)胞的凋亡指數(shù)是最少的， 而控制性降壓組的凋亡指數(shù)是最嚴(yán)重的。同時，與控制性降壓組比較，用藥三組凋亡指數(shù)降壓，說明烏司他丁有效減輕控制性降壓引起的腦缺血缺氧腦損傷的細(xì)胞凋亡。而用藥三組之間比較

13、顯示，降壓后給藥組細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重。說明在用藥三組比較，降壓后給藥，神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較多。綜上所述，烏司他丁對控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護(hù)作用，其可能抑制Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)；在三組給藥的不同時段比較中，降壓前+降壓后給藥組Caspase-3的表達(dá)最少；由此說明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時給藥。參考文獻(xiàn)：1 Mcleod ME ，Creighton RE，Humphreys RP.Anaesthetic management of arteriovenous malfolinations of the vein of Galen.Can Anaesth

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