糖化酶制劑測定方法QBT1803-93

1、湖北立業(yè)生物制品有限公司 文件類型 技術(shù)文件 批準人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件編號 實施日期 2006(10(1糖化酶測定方法1/3 執(zhí)行部門 質(zhì)控部 頁碼1. 試驗方法(除酶活力項目外，其它項目按QB/T1803-93標準執(zhí)行) 1.1 酶活力測定1.1.1 定義1ml液體酶(或1g固體酶粉)，于40?、PH4.6的條件下，1小時分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為一個酶活力單位，以u/ml(u/g)表示。1.1.2 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解,1.4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉，酸化后析

2、出碘，再用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，計算出酶活力。1.1.3 試劑和溶液1.1.3.1 乙酸,乙酸鈉緩沖溶液 (PH4.6)稱取乙酸鈉(CHCOONa?3HO)6.7g，溶于水中，加冰乙酸(CHCOOH)2.6ml，用水定容323至1000ml。配好后用PH計校正。1.1.3.2 硫代硫酸鈉標準溶液C(NaSO)=0.05mol/L 223a 配制:稱取硫代硫酸鈉(NaSO5HO)12.4克和碳酸鈉0.1克溶于煮沸后冷卻的蒸溜223.2水中，定容至1000ml，儲于棕色瓶中密閉保存，配制后放置一星期標定使用。b標定:碘酸鉀法稱取預先在100,105?烘至恒重的分析純碘酸鉀(KIO)3.567克，

3、溶于1000ml蒸餾水3中，即成0.1mol/L碘酸鉀溶液。然后吸取10ml于150ml三角瓶中，加入0.5克碘化鉀(KI)，溶解后加入1mol/LHSO2ml，用待標定的0.05mol/L NaSO溶液來滴定，滴至淡黃色時，24 223加1%淀粉指示劑2,3滴，繼續(xù)滴定至無色為終點。c 計算:碘酸鉀溶液的摩爾濃度10NaSO 溶液的摩爾濃度= 223消耗NaSO的ml數(shù) 2231.1.3.3 碘標準溶液碘溶液C(1/2 I)=0.1mol/L 2a 配制:稱取碘化鉀(KI)36克溶解在100ml蒸餾水中，再加入碘(I)12.691克溶解2稀釋至1000ml貯于棕色瓶。b 標定:用已標定的0.

4、05mol/L NaSO溶液來標定碘溶液。 223吸取10ml待標定的碘液放入250ml碘量瓶中，以0.05mol/L NaSO溶液滴定至淡黃色時，223加入1%淀粉指示劑2,3滴，繼續(xù)滴定至無色為終點。湖北立業(yè)生物制品有限公司 文件類型 技術(shù)文件 批準人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件編號 實施日期 2006(10(1糖化酶測定方法2/3 執(zhí)行部門 質(zhì)控部 頁碼c 計算:0.05消耗NaSO的ml數(shù) 223碘溶液的摩爾濃度= 101.1.3.4 氫氧化鈉溶液C(NaOH)=0.1mol/L稱取氫氧化鈉4g，用水溶解并定容至1000ml。1.1.3.5 200g/L氫氧化鈉溶液稱取氫

5、氧化鈉20g，用水溶解并定容至100ml。1.1.3.6 硫酸溶液C(1/2 HSO)=2mol/L 24量取濃硫酸(密度為1.84)5.6ml，緩緩注入80ml水中，冷卻后，定容至100ml。 1.1.3.7 20g/L可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉(以絕干計)2.000g，精確至0.0001g，用水調(diào)成漿狀物，在攪動下緩緩傾入70mL沸水中，加熱煮沸2分鐘直至完全透明，冷卻至室溫，全部移入100mL容量瓶，用水稀釋至刻度線。此溶液必須當天配制。1.1.3.8 10g/L淀粉指示劑將20g/L可溶性淀粉溶液稀釋一倍。1.1.4儀器和設(shè)備1.1.4.1 恒溫水浴40?0.2?1.1.4.2 秒表

6、1.1.4.3 比色管50ml1.1.5 分析步驟1.1.5.1 待測酶液的制備稱取酶粉1,2克，精確至0.002g(或吸取液體酶1.00ml)，先用少量的乙酸鈉緩沖液溶解，并用玻璃攪拌棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中，如此搗研3,4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度(使酶活力在100,250u/ml范圍內(nèi))，搖勻。供測定用。 1.1.5.2 測定1.1.5.2.1 于甲、乙兩支50ml比色管中，分別加入可溶性淀粉溶液25.0ml及緩沖液5.00ml搖勻后，于40?0.2?恒溫水浴中預熱5min。在甲管(樣品)中加入待測酶液2.00ml，立刻搖勻，在此溫度下準確反應(yīng)30min，立即各

7、加200g/L氫氧化鈉溶液0.20ml，將兩管取出迅速冷卻，并于乙管(空白)中補加待測酶液2.00ml。1.1.5.2.2 吸取上述反應(yīng)液與空白液5.00ml，分別置于碘量瓶中，準確加入碘溶液10.0ml，再加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.0ml，搖勻、密塞，于暗處反應(yīng)15min。取出，加硫酸溶液2.0ml，立即用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，直至藍色剛好消失為其終點。湖北立業(yè)生物制品有限公司 文件類型 技術(shù)文件 批準人 余少文Q/LYTM02-01-16 文件編號 實施日期 2006(10(1糖化酶測定方法3/3 執(zhí)行部門 質(zhì)控部 頁碼注:不同的稀釋倍數(shù)，應(yīng)做相應(yīng)的空白試驗。1.1.6 計算X=(A-B)C 90.05 32.2/5 1/2 n 2 = 579.9 (A-B)C n式中:X 樣品的酶活力，u/g (u/ml);A 空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，ml;B 樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，ml;C 硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L;90.05 與1.00ml硫代硫酸鈉標準溶液,c(NaSO)= 1.000mol/L, 相當以223克表示的葡萄糖的質(zhì)量。3