桑國(guó)俊 牛胚胎移植技術(shù)研究與應(yīng)用

1、 牛胚胎移植技術(shù)研究與應(yīng)用 甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所研究員桑國(guó)俊2011年8月3日1主 要 內(nèi) 容 一、胚胎移植技術(shù)基本概念 二、胚胎移植技術(shù)的研究史 三、胚胎移植技術(shù)技術(shù)要點(diǎn) 四、胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化 2一、胚胎移植技術(shù)基本概念 1、胚胎（embryo） 2、胚胎移植（embryo transfer,ET） 3胚胎 有性繁殖的動(dòng)物均有兩個(gè)特殊的生殖細(xì)胞，即雄性生殖細(xì)胞（精子）和雌性生殖細(xì)胞（卵子）。精子和卵子在一定的條件下相遇，并互相融為一體，稱為受精。受精卵通過細(xì)胞分裂從單細(xì)胞生命逐漸發(fā)育為多細(xì)胞的小生命，叫做囊胚。從單細(xì)胞期的受精卵到多細(xì)胞的囊胚期小生命叫做胚胎或者早期胚胎4早期胚發(fā)生

2、過程簡(jiǎn)圖精子 卵子受精卵（合子）2-細(xì)胞期胚4-細(xì)胞期胚8-細(xì)胞期胚16-細(xì)胞期胚桑椹胚囊 胚5 胚胎移植 也稱受精卵移植。是指將一頭雌性動(dòng)物（供體）的受精卵或早期胚胎移植到另一頭雌性動(dòng)物（受體）體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為與供體動(dòng)物具有相同基因型后代的技術(shù)過程 還可以表述為利用家畜超數(shù)排卵技術(shù)、同期發(fā)情技術(shù)、人工受精技術(shù)、胚胎采集、胚胎培養(yǎng)和鑒定技術(shù)，以借腹懷胎的形式快速純繁和擴(kuò)群優(yōu)秀高產(chǎn)畜禽、頻危和珍惜動(dòng)物的一項(xiàng)新的家畜繁殖技術(shù)6胚胎移植的意義1、充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率2、加速品種改良，擴(kuò)大良種畜群3、引進(jìn)良種家畜的有效途徑4、遺傳資源保存上的應(yīng)用5、誘發(fā)肉用畜懷雙胎，提高生產(chǎn)效

3、率6、作為研究手段促進(jìn)相關(guān)學(xué)科發(fā)展7、防疫需要和克服不孕7 胚胎移植技術(shù)的效益分析 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界目前年產(chǎn)胚胎移植牛超過35萬(wàn)頭。美國(guó)、法國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家每年參加后裔測(cè)定的青年公牛的80%來(lái)自胚胎移植所產(chǎn)的后代 根據(jù)農(nóng)業(yè)部科技司推薦的方法計(jì)算，平均每頭胚胎移植后代比土種牛增加的直接經(jīng)濟(jì)效益為萬(wàn)元。 現(xiàn)在全國(guó)年產(chǎn)犢牛約5000萬(wàn)頭，按照每年胚胎移植牛個(gè)百分點(diǎn)計(jì)算，年總經(jīng)濟(jì)效益將高達(dá)175億元，市場(chǎng)潛力巨大8二、胚胎移植技術(shù)的研究史時(shí)間 主要成果 發(fā)表人 1890 家兔胚胎移植獲得成功(命普)英1934 綿羊胚移獲得成功 Warwick,B1949 山羊胚移獲得成功 Warwick,B1951

4、豬的胚移獲得成功 Kvansnikii,A1961 綿羊國(guó)際間移植獲得成功1964 牛的非手術(shù)移植獲得成功杉江佶等1971 世界第一個(gè)胚移公司成立 Albeta Livestock Trasplants Ltd 1972 牛凍胚移植獲得成功Wilmut,I & Rowson,I1979 綿羊分割胚移植成功Willadsen,S1981 牛分割胚移植成功Willadsen,S1982 牛體外受精卵移植成功 Brackett,B1984 山羊體外受精卵移植成功花田章，旭日干 時(shí)間 主要成果 發(fā)表人 1890 家兔胚胎移植獲得成功(命普)英1934 綿羊胚移獲得成功 Warwick,B1949 山羊

5、胚移獲得成功 Warwick,B1951 豬的胚移獲得成功 Kvansnikii,A1961 綿羊國(guó)際間移植獲得成功1964 牛的非手術(shù)移植獲得成功杉江佶等1971 世界第一個(gè)胚移公司成立 Albeta Livestock Trasplants Ltd 1972 牛凍胚移植獲得成功Wilmut,I & Rowson,I1979 綿羊分割胚移植成功Willadsen,S1981 牛分割胚移植成功Willadsen,S1982 牛體外受精卵移植成功 Brackett,B1984 山羊體外受精卵移植成功花田章，旭日干 9中國(guó)胚胎工程研究60年代魚類、兩棲類的細(xì)胞核移植(童第周)70-80年代ET 兔

6、(1973)、綿羊（1974）、奶牛（1978）、山羊（1980）、小鼠（1980）、馬（1982）、豬70年代末-80年代初胚胎冷凍 兔（1979）、奶牛（1981）、綿羊（1982）、山羊（1982）80年代嵌合動(dòng)物 小鼠（1982）、兔（1988）、山羊（1993）80年代胚胎分割 小鼠（1986）、奶牛（1987）、山羊（1987西農(nóng)）、綿羊（1987）、兔（1990）80年代末體外受精 試管嬰兒（1986）、 試管動(dòng)物 小鼠（1987）、兔（1990）、牛（1989）、綿羊（1989）、山羊（1991）90年代細(xì)胞核移植山羊（1990），兔（1991）、牛（1995）、豬（1995）

7、、小鼠（1996）90年代連續(xù)細(xì)胞核移植 1993年，中科院發(fā)育所獲得第二代核移植山羊。19921996年，西農(nóng)大得到第1代至第5代核移植山羊。1995年，西北農(nóng)大將滋養(yǎng)層細(xì)胞作為供體細(xì)胞，獲得山羊10甘肅省胚胎移植概況1985年前后，日本人在張掖臨澤實(shí)施了奶牛胚胎移植，但未推廣19972005年，甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所、甘肅省家畜繁育中心、平?jīng)龅貐^(qū)畜牧獸醫(yī)工作站在平?jīng)龅貐^(qū)實(shí)施了肉牛、奶牛的胚胎移植1997？2005年，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位開展了大量的牛羊胚移技術(shù)研究與應(yīng)用工作11三、胚胎移植技術(shù)要點(diǎn) 1.供體和受體的選擇 2.胚胎生產(chǎn) 3.胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià) 4.胚胎保存 5.受體牛的同期發(fā)情處理 6

8、.胚胎移植 7.妊娠牛的管理12胚胎移植過程示意圖13超數(shù)排卵發(fā)情輸精（配種）胚胎回收發(fā)情胚胎移植妊娠正常繁殖或2個(gè)月之后再次進(jìn)行超排處理優(yōu)秀供體母牛受體母牛IVF胚胎141.供體、受體的選擇供體的選擇常規(guī)的胚移首先需要選擇理想的良種家畜品種作為供胚動(dòng)物。以牛的胚移為例，在供體牛品種確定之后，首先應(yīng)根據(jù)個(gè)體檔案選擇那些遺傳性能優(yōu)良和穩(wěn)定的健康母牛作為候選牛。然后再根據(jù)營(yíng)養(yǎng)狀況、繁殖力、發(fā)情周期、年齡、對(duì)超排的反應(yīng)及自然排卵正常與否等指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步選擇最理想的供體群，然后重新建立嚴(yán)格的供體檔案，并根據(jù)在胚移過程中的實(shí)際情況重新評(píng)價(jià)或淘汰個(gè)別供體。供體由胚胎生產(chǎn)方實(shí)施受體的選擇原則上是選擇那些生產(chǎn)性

9、低，數(shù)量多，健康無(wú)病，發(fā)情周期正常的適齡母牛作為移植受體。受體牛的狀況對(duì)移植效果影響很大。見下表15受體牛的選擇標(biāo)準(zhǔn) 1 應(yīng)有兩個(gè)以上正常的發(fā)情周期 2 無(wú)繁殖機(jī)能疾病、炎性分泌物 3 無(wú)傳染?。ㄌ貏e是布氏桿菌?。?4 身體健康，膘情在7成以上（按5級(jí)膘情分級(jí)，應(yīng)為3-4級(jí)） 5 牛齡為26歲，體型較大，能承擔(dān)妊娠和分娩工作 6 經(jīng)產(chǎn)牛分娩在60d天以上，第一次發(fā)情一般不移植 7 產(chǎn)犢性能和泌乳性能良好 ，情性溫順 8 人工授精兩次或胚胎移植兩次不孕者不使用 9 無(wú)流產(chǎn)史，上胎無(wú)難產(chǎn)、助產(chǎn)情況 ，子宮彈性厚薄正常 10 黃體達(dá)到A、B級(jí) 11 青年牛達(dá)到16月齡以上，體重達(dá)到成年母牛體重的75

10、%12 品種 供體的生產(chǎn)性能非常突出，受體可不受生產(chǎn)性能的制約162.胚胎生產(chǎn) 體內(nèi)受精胚 超數(shù)排卵處理 授精處理 受精卵(胚)的回收(手術(shù)、非手術(shù)) 體外受精胚 屠宰牛卵巢的采集or活體采卵 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng) 成熟卵的授精處理 受精卵的發(fā)育培養(yǎng)17常用超排處理方法根據(jù)供體動(dòng)物本身的血清激素水平的變化而設(shè)計(jì)，不同動(dòng)物、不同個(gè)體和不同藥物的處理方法不盡相同。牛通常在發(fā)情后第914天內(nèi)進(jìn)行處理 1 PMSG-HCG處理法 2 PGF2-PMSG(FSH)處理法 3 FSH-LH-PGF2處理法（最常用）18各國(guó)超排處理一覽表19發(fā)情期激素水平和變化規(guī)律20比較典型的超數(shù)排卵日程安排備注：寧波40

11、0-600iu；中動(dòng)9-12mg；加拿大300-400mg21供體牛、羊的超排激素劑量 減量注射牛FSH8-12mg（中動(dòng)）or400mg（加拿大）， 1d2次,4d8次；PG0.81mg，1d2次；LH200-400iu，AI2-3次，凍精4-6支FSH400-600iu（寧波），4d8次；PG0.8-1mg，1d2次,4d8次；LH200-400iu，AI2-3次，凍精4-6支羊FSH4mg（中動(dòng)），3d6次；PG0.4mg，1d2次；LH100-200iu，AI2次，凍精4支FSH200iu（寧波），3d6次；PG0.4mg，1d2次；LH100-200iu，AI2次，凍精4支22非手術(shù)

12、采卵 牛非手術(shù)采卵目前已發(fā)展為一項(xiàng)成熟的實(shí)用技術(shù)。1973年日本的杉江首先試制成功了牛非手術(shù)采卵的專用設(shè)備即非手術(shù)采卵器(金屬三套管)，后經(jīng)過改進(jìn)和簡(jiǎn)化，成為目前普遍采用聚氯乙烯制作的帶有球囊的雙通路導(dǎo)管 牛非手術(shù)采卵是一項(xiàng)技術(shù)性較強(qiáng)的操作過程，必須由經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的專業(yè)人員操作，在采卵過程中必須注意以下幾點(diǎn) 1)供體牛的選擇、管理和超排 2)采卵時(shí)間的確定(發(fā)情第7、8天) 3)采卵器具和沖卵液的準(zhǔn)備(見附表) 4)沖卵前準(zhǔn)備(保定、麻醉、清洗、滅菌和器具安裝) 5)沖卵(沖卵液的灌流和胚胎回收) 6)沖卵后供體牛的處理(宮得康、PG) 7)檢胚和受精卵的質(zhì)量檢查 注意點(diǎn)：熟練、無(wú)菌、保溫23

13、牛胚胎的基本發(fā)育階段 移植胚胎與發(fā)情后生殖道周期相吻合24沖胚示意圖25262728 CL (Corpus Luteum)The CL takes the place of the follicleProduces the hormone progesterone29附表 牛非手術(shù)采卵用器具和藥品試劑采卵器內(nèi)芯子宮采卵器(16-24號(hào)多孔式采卵器)粘液去除器及宮頸擴(kuò)張器(選用)乳膠輸液管及其控制系統(tǒng)注射器：打氣(20ml)、輸入輸出液體尾椎麻醉(10ml)酒精棉剪毛剪麻醉藥(靜松林or2%普魯卡因)量筒(500ml)回收卵過濾器塑料手套(無(wú)菌)30 附表 PBS沖卵液的配方（g/l） NaCl

14、 KCl CaCl2 KH2PO4 MgCl26H2 Na2HPO4 丙酮酸鈉 葡萄糖 牛血清蛋白 青霉素 100iu/ml 鏈霉素 100g/ml 雙蒸水 1000ml313 胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià) 采集到的胚胎必須經(jīng)過可用性測(cè)定，才能用于移植或冷凍保存 常用的方法有形態(tài)學(xué)鑒別法(根據(jù)胚胎形態(tài)，發(fā)育階段)、短期培養(yǎng)法、熒光物質(zhì)代謝法(利用二乙酰熒光素FDA)和死細(xì)胞熒光法(利用二味基苯吲哚)等 321-cell2-cell8-cellMorulaBlastocystInner Cell Mass(ICM)BlastocoelTrophectoderm(TE)(A)(B)(C)(D)(E)33牛胚胎發(fā)育

15、特征34 根據(jù)常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒別法可以把胚胎分為三級(jí) A級(jí)(優(yōu)良)胚胎輪廓清晰、顏色均勻、細(xì)胞密度良好、不見細(xì)胞外突和水泡等 B級(jí)(一般)胚胎輪廓清晰、顏色均勻、細(xì)胞密度良好、有突起細(xì)胞和水泡等，細(xì)胞變形率10-20% C級(jí)(較差)輪廓不清、顏色發(fā)黑、細(xì)胞數(shù)減少、外突細(xì)胞較多、變形率30-50% 通常鮮胚移植時(shí)，A級(jí)和B級(jí)胚均可采用，用于冷凍保存時(shí)，通常只選擇A級(jí)胚，因?yàn)橘|(zhì)量較差的胚胎抗凍性較差，因此不宜用于冷凍保存354.胚 胎 保 存 短期保存 活體保存 體外37保存 低溫(010)保存 長(zhǎng)期保存(冷凍保存，供參考) 常規(guī)冷凍保存 快速冷凍保存 玻璃化冷凍保存36常規(guī)的程序降冷凍方法以的甘油

16、、乙二醇等小分子量的滲透性低溫保護(hù)劑對(duì)胚胎進(jìn)行平衡，脫水，然后裝入細(xì)管內(nèi)，程序冷凍儀按1-2/min的速率降溫，在-7左右進(jìn)行植冰(自動(dòng)或人工)，然后繼續(xù)以0.3-0.6/min的速率降溫至-25 35投入液氮(-196)長(zhǎng)期保存。目前采用在此法基礎(chǔ)上建立的一步冷凍法解凍 按照冷凍程序逆向解凍，一步法可象細(xì)管凍精一樣直接解凍后應(yīng)用37快速冷凍方法采用2-4M的甘油或乙二醇和的蔗糖或乳糖為防凍劑，平衡30min即置于液氮蒸氣中快速降溫2min，然后投入液氮解凍 按照冷凍程序逆向解凍玻璃化冷凍方法它是利用高濃度的混合防凍劑的驟冷時(shí)形成一種非冰晶體的玻璃化狀態(tài),使胚胎免受損傷的方法。這種方法只須將裝

17、有胚胎的細(xì)管從室溫直接投入液氮即可（冷凍液 10%EG； 蔗糖PBS液； EFS30液） 解凍 按照冷凍程序逆向解凍38牛胚胎的冷凍保存技術(shù)常規(guī)程序冷凍冷凍液 PBS3FCS沖卵掖； PBS+10%EG； PBS+12.5%蔗糖一步冷凍方法裝管 10%EG第一液5min；10%EG第二液10min；四段法裝管：SU-AIR-SU-AIR-EG+EMB-AIR-SU。裝好后直接冷凍冷凍 以1Cmin從室溫降至-5.5- -7C時(shí)植冰，在-7C下停留10min；植冰后以0.3Cmin的速率降至-3035C，平衡10min后取出胚胎細(xì)管，直接投入液氮中保存解凍 解凍溫度38C，解凍速率300-500

18、Cmin解凍液PBS+20%FCS，一步法不用解凍液玻璃化冷凍冷凍液 10%EG； 0.5mol/l蔗糖PBS液； EFS30液冷凍方法裝管 10%EG中5min；EFS30液中5min；0.5mol/l蔗糖PBS液和EFS30液三段法裝管冷凍：SU-AIR-EFS30+EMB-AIR-SU冷凍 裝管結(jié)束后直接投入液氮中保存解凍 回收胚胎移入0.5Mol蔗糖液中，平衡5min脫出EG，在0.5mol蔗糖液或PBS液中清洗1-2遍后裝管移植。移植液用0.5mol蔗糖液或PBS液解凍液0.5mol/l蔗糖PBS液39液體配制50ml 12.5%蔗糖液的配制 蔗糖50ml 10%乙二醇的配制 45m

19、lPBS液+5mlEG，用0.22m25cm過濾器過濾后冷藏備用。5ml/瓶，-20EFS30液的配制 聚蔗糖蔗糖乙二醇液依次定溶至5ml40 5.受體牛的同步發(fā)情處理 自然發(fā)情 藥物誘導(dǎo)發(fā)情 藥物誘導(dǎo)發(fā)情是指以生殖激素(性激素)在雌性動(dòng)物性周期中作用為理論依據(jù)，應(yīng)用某些激素和激素類物質(zhì)人為的干預(yù)雌性動(dòng)生殖生理過程，從而使其按著人們預(yù)定的計(jì)劃和時(shí)間發(fā)情的技術(shù)過程41 目前的處理方法 抑制卵泡發(fā)育(孕酮處理) 抑制黃體形成(用前列腺素PGF2處理) 促卵泡成熟(用促性腺激素PMSG、hCG、 FSH和LH處理)42同期發(fā)情處理方法 同期化處理之前對(duì)受體牛進(jìn)行直腸觸摸，檢查卵巢是否處于活動(dòng)狀態(tài)。處

20、于活動(dòng)狀態(tài)的牛方可進(jìn)行同期化發(fā)情處理。常用前列腺素法 藥品 氯前列烯醇（PG）：支劑量 經(jīng)產(chǎn)牛次、育成牛次方法 二次注射法（肌注） 第一次注射：在黃體期任意一天 第二次注射：在第一次注射后11天。第二次注射后2496h觀察發(fā)情。受體牛發(fā)情之日計(jì)為0d，68d內(nèi)進(jìn)行胚胎移植 43 6.胚胎移植 以牛非手術(shù)移植為例，介紹移胚過程及要點(diǎn) 選擇同期發(fā)情處理后發(fā)情正常的受體牛,進(jìn)行尾根麻醉 移植前進(jìn)行黃體檢查，確認(rèn)黃體，并記錄 移卵器具的滅菌、消毒 移胚:將桑椹胚、囊胚和擴(kuò)張囊胚分別移到同步發(fā)情第6、7、8天的母牛子宮角內(nèi)。在整個(gè)過程中一定要注意無(wú)菌操作，縮短時(shí)間。胚胎污染或暴露時(shí)間過長(zhǎng)均會(huì)明顯降低受胚

21、率 移卵牛的管理和妊娠診斷44 胚胎的裝管和裝槍 將優(yōu)質(zhì)胚胎裝入的細(xì)管，用細(xì)管需經(jīng)過紫外線或氣體消毒。細(xì)管在裝管前須用培養(yǎng)液沖洗1-3次，注意不要弄濕棉塞。裝管前要根據(jù)移植槍的規(guī)格將細(xì)管用消毒剪剪掉一截（日式移植器，法式不剪），然后再把細(xì)管插在1ml注射器or乳膠管吸球上，從中吸取胚胎。 將裝有胚胎的細(xì)管裝人移值槍中，移值槍套有消毒過的塑料外鞘（日式or法式），再套上一層塑料套膜，防止移植槍在通過陰道時(shí)受到污染。當(dāng)移植槍進(jìn)入子宮頸外口后，將塑料套膜拉破。45 黃體的檢查 A 檢查黃體要在移植前或前一天實(shí)施B 用力觸摸黃體將引起黃體發(fā)生退化，因此要輕巧 C 當(dāng)黃體形狀不良有大卵泡存在時(shí)，或子宮收

22、縮過緊張時(shí)，不予移植 D 根據(jù)黃體的形態(tài)、大?。ㄓ檬持概卸ǎ┖蛷椥缘染C合判定定級(jí)。見下圖 A B C D 46影響牛胚胎移植妊娠率的因素影響胚胎受胎率的主要因素 胚胎質(zhì)量和胚移時(shí)間的同期性 受體牛的健康狀況和發(fā)情同期程度 操作人員的熟練程序及無(wú)菌操作程度 詳見下表471 胚胎因素胚胎發(fā)育階段 對(duì)應(yīng)期 胚胎質(zhì)量 A、B級(jí)體內(nèi)胚與體外胚 20-70%、10-30鮮胚與凍胚 凍胚復(fù)蘇率70%胚胎死亡（2540%） 染色體異常、自身免疫、感染性流產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)不良、內(nèi)分泌失良、年齡、環(huán)境482.受體因素品種年齡（胎次）飼養(yǎng)方式 舍飼、栓系、散養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)、飼養(yǎng)管理 高、中、低發(fā)情方式 自然、同期發(fā)情掌握程度 準(zhǔn)確

23、、供受體同期程度+1-1d黃體機(jī)能 A、B級(jí)正常情期 1822天子宮狀態(tài) 良無(wú)任何疾病 49 3.技術(shù)因素移植人員的技術(shù)水平 移植位置 黃體側(cè)、大彎部 通過宮頸的難易程度 子宮損傷程度 損傷、穿孔 防止污染 未脫膜、粘液 移植所用時(shí)間50四、胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化胚移技術(shù)出現(xiàn)100年來(lái)，其學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值隨著時(shí)間的推移越來(lái)越受到人們的重視。尤其是60年代以后，這一技術(shù)的發(fā)展尤為迅速原因有如下幾方面511、促進(jìn)家畜的育種與改良 如果說(shuō)AI的出現(xiàn)使公畜的繁殖潛力得到了最大限度地發(fā)揮，那么胚移技術(shù)的出現(xiàn)是提高母畜繁殖潛力的一次革命。這一技術(shù)可以使一頭良種母畜比平時(shí)多排幾倍至幾十倍的卵子，受精后可以形成大量的胚胎，把這些胚胎移植給普通的受體母畜，就可以在短時(shí)間獲得大批良種后代。美國(guó)人曾經(jīng)用這種方法在兩年內(nèi)從一頭良種奶牛得到了200頭良種后代，而用傳統(tǒng)的育種方法，這是絕對(duì)不可能的 利用胚移技術(shù)不僅可以加速育種速度，而且可以促進(jìn)特定家畜和動(dòng)物品種的繁殖增產(chǎn)。例如原西德的研究人員曾將東印度的野牛胚胎移植給普通奶牛，使奶牛產(chǎn)出了小野牛；美國(guó)將斑馬胚胎移植給普通馬，生出小斑馬。這意味著人們可以利用胚移技術(shù)