細胞培養(yǎng)技術(shù)課件

1、細胞培養(yǎng)技術(shù)藥物科學與技術(shù)學院 周立軍細胞培養(yǎng)技術(shù)藥物科學與技術(shù)學院參考書目細胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年培養(yǎng)細胞學與細胞培養(yǎng)技術(shù) ，上海科學技術(shù)出版社，2004年參考書目細胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年本次課內(nèi)容細胞培養(yǎng)的基本知識一、緒論 培養(yǎng)法的種類、培養(yǎng)法的發(fā)展、細胞培養(yǎng)的常用術(shù)語、培養(yǎng)細胞的作用及意義、培養(yǎng)法的應(yīng)用二、培養(yǎng)細胞的特征 培養(yǎng)細胞的生長方式和類型、 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程、 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素本次課內(nèi)容細胞培養(yǎng)的基本知識一、緒論一、緒論一、緒論細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 即：從活體中取出小塊組織分離出

2、細胞，在一定條件下進行培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。涉及有細胞生物學、生物化學與分子生物學、動物學與植物學、病原學、腫瘤學、遺傳學、生物工程學甚至光學、物理學等等學科。因其涉及面很廣所以已經(jīng)滲透到生命科學的各個領(lǐng)域。細胞培養(yǎng)（cell culture)細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（tissue culture）： 其本意是指從體內(nèi)取出組織和細胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（tissue culture）：器官培養(yǎng)（Organ culture

3、）： 指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法，以上三個層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（in vitro）。器官培養(yǎng)（Organ culture）：培養(yǎng)法的種類體外培養(yǎng) 細胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)法的種類體外培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)體外培養(yǎng)種類體細胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。群體培養(yǎng)（mass culture）：即將大量細胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長，形成均勻的單層細胞或單細胞懸液。克隆培養(yǎng)（clone culture）：即將少數(shù)細胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠，經(jīng)過繁殖每一

4、個細胞形成一個集落，稱為克隆。細胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細胞散布于培養(yǎng)瓶底，個別集落形成，細胞圍繞中心漩渦狀排列100原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細胞散布于培養(yǎng)瓶底，個別集落形成，細原代培養(yǎng)第7天，多個集落形成并融合100 原代培養(yǎng)第7天，多個集落形成并融合100 培養(yǎng)法的發(fā)展組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。德國人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存活數(shù)月被認為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗。1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細胞生活一個月，提示組織或細胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍

5、能生存。發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。哈里森（生理學家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓節(jié)段在淋巴液中進行培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察到從神經(jīng)芽細胞延伸出神經(jīng)軸突的狀況。建立起一套合理的無菌培養(yǎng)技術(shù) 哈里森懸滴培養(yǎng)法發(fā)展簡史培養(yǎng)法的發(fā)展關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。發(fā)展簡史哈里森懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)物凝固的淋巴凹玻片槽蓋玻片將蛙胚原始脊髓節(jié)段，移到事先滴有從成體蛙淋巴囊吸取的新鮮淋巴的蓋玻片上，淋巴很快凝固，使組織小塊固定在一定的位置上。然后將蓋玻片倒置于一塊中央凹陷的厚載玻片上，蓋玻片的周緣用蠟封固。蛙胚神經(jīng)組織存活了數(shù)周體外培養(yǎng)組織和細胞的

6、基本模式系統(tǒng)。發(fā)展簡史哈里森懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)物凝固的淋巴凹玻片槽蓋玻片將蛙胚原始脊髓卡氏瓶的發(fā)明Carrel用反復(fù)傳代的方法使細胞系存活34年。他采用的無菌技術(shù)，以及后來設(shè)計的培養(yǎng)瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是對組織培養(yǎng)的重要貢獻。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。發(fā)展簡史卡氏瓶的發(fā)明Carrel用反復(fù)傳代的方法使細胞系存活34年。組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖 1923年，Carrel設(shè)計了卡式瓶培養(yǎng)法，擴大了組織的生存空間。1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染。發(fā)展簡史組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖 1923年，Carrel設(shè)計了卡式瓶培養(yǎng)1957年Dulbe

7、cco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了的單層細胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)成了組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。促進了細胞系(cell line)的建立。近年各種條件已商品化系列化，應(yīng)用冷凍技術(shù)，各國建立細胞庫 發(fā)展簡史1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體我國組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀30年代傳入我國。20世紀50年代起步。20世紀70年代，成為醫(yī)學和生物學研究中應(yīng)用的手段。我國組織培養(yǎng)的發(fā)展20世紀30年代傳入我國。組織培養(yǎng)常用術(shù)語 原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)（passage culture）：將細胞

8、以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 注：傳代（passage，subculture）組織培養(yǎng)常用術(shù)語 原代培養(yǎng)（primary cultur原代培養(yǎng)胎兒細胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細胞、腎上皮細胞比較容易，上皮細胞培養(yǎng)難。細胞間的分離酶：胰蛋白酶、膠原酶、單一種類細胞的分離培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基、細胞接著面的條件、接著速度、離心法等。術(shù)語原代培養(yǎng)胎兒細胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細胞、腎上皮細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。細胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培

9、養(yǎng)物或細胞系中獲得的特殊性質(zhì)或標志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物?？寺。╟lone）：指單個細胞通過有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳性狀相同的細胞群體。術(shù)語細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細有分化特性的細胞系和細胞株組織來源細胞系增殖性物種分化特性脾Friend永生小鼠合成血紅蛋白Morris肝癌HTC永生 大鼠酪氨酸轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)髓性白血病K562永生人合成血紅蛋白垂體瘤GH2,GH3永生大鼠產(chǎn)生生長激素黑色素瘤B16永生小鼠產(chǎn)生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白膠質(zhì)瘤CCM永生人膠質(zhì)纖維酸性蛋白成神經(jīng)細胞瘤C1300永生大鼠生長軸突有分化特性的細胞系和細胞株組織來源細胞系增殖

10、性物種分化特性脾對細胞培養(yǎng)技術(shù)的評價優(yōu)點：1、活細胞： 能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動；2、可控制： 選擇對象：均一性、重復(fù)性（類型、性質(zhì)、階段） ； 調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學、生物等因素）； 利用方法：研究技術(shù)、記錄方法；3、應(yīng)用廣： 領(lǐng)域多：醫(yī)學研究、生物技術(shù)、基因工程等 對象廣：各種動物（低等動物-高等動物-人類） 一種動物（不同年齡、不同組織） 正?；虍惓＃[瘤）4、較經(jīng)濟： 可提供大量、同時、重復(fù)性好的、生物學性狀相似的實驗對象；對細胞培養(yǎng)技術(shù)的評價優(yōu)點：缺點： 1、培養(yǎng)細胞會發(fā)生改變； 2、對人員、設(shè)備等要求較高。與體內(nèi)主要不同 相對孤立、相對單一、缺乏

11、體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)、分化減弱、細胞趨向單一化。 提示 要正確認識體外培養(yǎng)細胞是一種特定條件下生長的細胞群體。對細胞培養(yǎng)技術(shù)的評價缺點：對細胞培養(yǎng)技術(shù)的評價細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究、觀察內(nèi)容細胞內(nèi)活動：例如能量的代謝、DNA轉(zhuǎn)錄、凋亡及蛋白合成等。細胞內(nèi)部與細胞外界之間的作用：如細胞對外界刺激的反應(yīng)、藥物對細胞的作用、細胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌等。細胞間的相互作用：如形態(tài)發(fā)生、細胞間的粘著作用、接觸抑制、密度抑制等。細胞內(nèi)的流動：如信號傳導(dǎo)、鈣離子的流動、RNA的移動、激素受體復(fù)合物的易位等。遺傳學：如遺傳分析、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等。細胞培養(yǎng)技術(shù)

12、的研究、觀察內(nèi)容細胞內(nèi)活動：例如能量的代謝、DN細胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域 （一）、在病毒學研究中的應(yīng)用 （二）、在免疫學研究中的應(yīng)用 （三）、在分子生物學研究中的應(yīng)用 （四）、在遺傳學研究中的應(yīng)用 （五）、在藥理學研究中的應(yīng)用 （六）、在毒理學研究中的應(yīng)用 （七）、在腫瘤學研究中的應(yīng)用 （八）、在器官移植中的應(yīng)用細胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域 （一）、在病毒學研究中的應(yīng)用病毒檢驗方法病毒學病毒培養(yǎng)全程5-30天細胞病變判定熒光染色：1. 病毒涂片2. 血清型專一 抗體熒光染色中和試驗：培養(yǎng)出的病毒與血清型專一性抗血清作用，再接種至細胞病毒培養(yǎng)：1.細胞培養(yǎng)2.接種至細胞病毒檢驗方法病毒學病毒培養(yǎng)全程5-30天細

13、胞病變判定熒光染色檢測病毒 C P E正常細胞病變細胞檢測病毒 C P E正常細胞病變細胞雜交瘤技術(shù)Hybridomas免疫學脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命Khler和Milstein, 19751984年Nobel醫(yī)學獎雜交瘤技術(shù)Hybridomas免疫學脾細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細培養(yǎng)上清中X抗體的檢測克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測雜交瘤細胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動物免疫 細胞融合混合細胞的HAT篩選) 分泌X抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞X抗原B淋巴細胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細胞死亡 無限生長細胞 分泌X抗體

14、只有雜交瘤細胞可長期存活下來BALB/c單克隆抗體制備免疫學培養(yǎng)上清中X抗體的檢測單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測在分子生物學研究中的應(yīng)用1、 體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化2、 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)3、基因診斷和基因治療在分子生物學研究中的應(yīng)用1、 體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化器官移植組織工程種子細胞（干細胞）支架材料器官移植組織工程種子細胞（干細胞）組織工程組織工程細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)二、培養(yǎng)細胞的基本特征 培養(yǎng)細胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素二、培養(yǎng)細胞的基本特征 培養(yǎng)細胞的

15、生長方式和類型（一）培養(yǎng)細胞的生長方式和類型粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才 能生長的細胞。 如：成纖維細胞、心肌與平滑肌細胞、表皮細胞、骨與軟骨細胞、腫瘤細胞懸浮型細胞：不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。 如：血、脾及骨髓培養(yǎng)的細胞及某些癌細胞 （一）培養(yǎng)細胞的生長方式和類型粘附型細胞：附著在某一固相支持粘附型（貼壁型）細胞 粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 細胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：細胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時 明顯不同。粘附型（貼壁型）細胞 粘附:是大多數(shù)有機體細

16、胞在體內(nèi)生存和粘附型細胞 體外培養(yǎng)下，形態(tài)異?？煞从称渑邔悠鹪?，按照培養(yǎng)細胞的形態(tài)，可分為幾大類型： 成纖維型細胞 上皮型細胞 游走型細胞 多形型細胞粘附型細胞 體外培養(yǎng)下，形態(tài)異?？煞从称渑邔悠鹪?，按照成纖維型細胞上皮型細胞成纖維型細胞上皮型細胞游走型細胞多形型細胞游走型細胞多形型細胞成纖維型細胞來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細胞，如：成纖維細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞。 形態(tài)：類似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起，中央有卵圓形核。生長特點：排列成放射狀，漩渦狀生長。成纖維型細胞來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細胞，如：成纖維細胞上皮型

17、細胞來源：起源于內(nèi)、外胚層的細胞，如：皮膚及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性腫瘤等。形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞，呈扁平、不規(guī)則、多角形，中有圓形核。生長特點：細胞緊密相連成單層膜 相靠緊密相連成薄層鋪石狀 上皮型細胞來源：起源于內(nèi)、外胚層的細胞，如：皮膚及其衍生物、 培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而發(fā)生改變，如pH、細胞密度、污染等因素。 HeLa細胞： 血清 高血清成纖維樣細胞 低血清上皮樣細胞 pH 標準pH上皮樣細胞 太酸或太堿成纖維樣細胞 細胞密度 低密度成纖維樣細胞 高密度上皮樣細胞 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化成纖維樣細胞 轉(zhuǎn)化后上皮樣細胞粘附型細胞 培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而

18、發(fā)生改細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮型細胞 概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長。 來源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白細胞腫瘤細胞為主。 特點：在懸浮中生長良好，細胞圓形，呈單個或小細胞團。 懸浮型細胞 概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以 優(yōu)點： 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點： 觀察不方便 很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)懸浮型細胞 優(yōu)點： 生存空間大，提供數(shù)量大懸浮型細胞細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細胞的生長特點 粘附并伸展 是大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。細胞在接種后很快便可見到細胞伸出偽足附著，與支

19、持物形成一些接觸點，接著細胞逐漸呈扁平或放射狀伸展，逐漸形成上皮型或成纖維型或其他類型生長。 密度依賴性 細胞接種密度過高或過低都會影響細胞的生長、增殖。當細胞粘附生長、融合成單層時，細胞變得較為擁擠，而扁平形狀的程度減少，與培養(yǎng)基的接觸面減少，同時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物逐漸消耗，細胞分裂減弱，增殖減慢。培養(yǎng)細胞的生長特點 粘附并伸展二、培養(yǎng)細胞的生長增殖過程單個細胞的細胞周期（cell cycle）細胞系的生長過程培養(yǎng)細胞傳代的生存期二、培養(yǎng)細胞的生長增殖過程單個細胞的細胞周期（cell cy單個細胞的細胞周期（cell cycle）生長增殖過程MG1SG2間期DNA合成期前中后末有絲分裂期單個

20、細胞的細胞周期（cell cycle）生長增殖過程MG組織培養(yǎng)細胞生命期原代培養(yǎng)期傳 代 期衰 退 期組織培養(yǎng)細胞生命期原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 又稱初代培養(yǎng)期 （primary culture），從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。 此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛；細胞形態(tài)相似。 細胞群是異質(zhì)的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。原代培養(yǎng)期 又稱初代培養(yǎng)期 （primary cult傳代培養(yǎng)期初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系cell line。此期為三期中最長，可維持二倍體核型（二倍體細胞系）。當傳代3050代后，細胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。

21、衰退期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。傳代培養(yǎng)期體外培養(yǎng)細胞一代增殖生長過程體外培養(yǎng)細胞一代增殖生長過程第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線 接觸抑制（contact inhibition）：貼壁生長的體外正常細胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進入S期，也不會出現(xiàn)交叉重疊生長。 惡性細胞無接觸抑制現(xiàn)象，所以可將其作為區(qū)別正常細胞與癌細胞的標志之一。 密度抑制（density inhibition）：培養(yǎng)液營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。培養(yǎng)細胞生長過程中的特點 接

22、觸抑制（contact inhibition）：貼壁 傳代細胞可連續(xù)傳710代，細胞形狀基本相同，但隨著傳代次數(shù)增多，細胞逐漸呈老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為:細胞增殖速度明顯減慢，胞漿中出現(xiàn)空泡及顆粒樣物質(zhì)，細胞碎片增多，細胞形態(tài)變?yōu)楸馄剑ベN壁能力，從培養(yǎng)瓶底脫落。 傳代細胞可連續(xù)傳710代，細胞形狀基本相同，但隨三、細胞培養(yǎng)的條件 水高度純化 糖葡萄糖 氨基酸12種 維生素 無機離子和微量元素 促生長因子三、細胞培養(yǎng)的條件 水高度純化各種培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血清添加蛋白半合成培養(yǎng)基添加蛋白合成培養(yǎng)基無蛋白合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基血

23、清添加蛋白細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù)血 清 血清的種類 血清的主要成分及主要作用 血清的使用與儲存 影響血清的各種因素 細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點血 清 血清的種類1、血清的種類 胎牛血清：剖腹產(chǎn)的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之內(nèi)的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛 （人血清、馬血清、羊血清）2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長活性是達到生理平衡的。1、血清的種類A因子：能促進細胞早期生長，縮短潛伏期，清除細胞內(nèi)脂肪滴。B因子：是一種脂肪形成劑，易使細胞產(chǎn)生脂肪滴，

24、其本身是可溶性脂類。 B因子在老年血清中含量較多， 過濾可除去該因子。C因子：可使細胞發(fā)生退化。D因子：可促使細胞粘連，是一種粘著 因子。去除B、C因子，可促進細胞生長A因子：能促進細胞早期生長，縮短潛伏期，清除細胞內(nèi)脂肪滴。去細胞培養(yǎng)技術(shù)血清的主要作用 提供基本營養(yǎng)物質(zhì) 提供貼壁和擴展因子（FN、LN） 提供激素及各種生長因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細胞障礙因素） 對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用注意點： 血清型號、種類不同，所含營養(yǎng)因素有差別，不可忽視； 在需要觀察細胞某種特性時，血清使問題變復(fù)雜，要除去。 血清的主要作用 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)血清

25、的使用與儲存 使用前的處理 56滅活30min 去除補體成分 （趨勢：大部分細胞培養(yǎng)不需滅活； 需要滅活的：巨噬細胞、肥大細胞、血小板、淋巴細胞等） 儲存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲存；使用前4 融化。 使用濃度 一般為520，最常用的是10。血清的使用與儲存 使用前的處理影響血清的各種因素 年齡：較老動物的血清對細胞生長有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對細胞生長有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好影響血清的各種因素 年齡：較老動物的血清對細胞生長有抑細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點 使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)

26、。 如：血清可以促進成纖維細胞的生長，同時會抑制表皮角質(zhì)細胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)細胞產(chǎn)生影響。細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點 使用血清有可能改變某種細胞在影響細胞生長的因素 溫度 滲透壓 氣體環(huán)境和pH 無毒和有毒 輻射線和超聲波 細胞接種密度 容器轉(zhuǎn)動速度和懸浮攪動速度影響細胞生長的因素 溫度溫 度 一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度3738，溫度過高或過低都會影響到細胞的生長。溫度對細胞生長的影響溫 度 一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫低 溫 在低溫下，細胞的代

27、謝活力及核分裂降低。 溫度不低于0 時，雖影響細胞代謝，但并無傷害作用；再把細胞置于2535 時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢。 若溫度過低，在降到冰點以下時，細胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。 若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲基亞砜等，封入凍存管，置于液氮中，細胞可耐受70 以下溫度，能長期儲存，解凍后細胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長增殖，生物性狀不受影響。低 溫 在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂降低。高 溫 細胞在40數(shù)小時后，再置回37 培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長；但如果在40 下暴露時間太長，對細胞生長不利，甚至變圓脫離瓶底。 細胞在3940 培養(yǎng)1h，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升

28、高2 ，持續(xù)數(shù)小時，即在4142 中培養(yǎng)1h，細胞損傷嚴重，溫度至43 以上時細胞多數(shù)被殺死。 高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性。高 溫 細胞在40數(shù)小時后，再置回37 培養(yǎng)氣體環(huán)境和pH 氧（O2）參加細胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。采用開放式培養(yǎng)時（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細胞置于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。氣體環(huán)境和pH 氧（O2）二氧化碳（CO2） CO2既是細胞的代謝產(chǎn)物，又是細胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。 大多數(shù)細胞適于在pH 7.27.4條件

29、下生長，低于pH 6.8或高于pH 7.6對細胞有害，甚至造成細胞退化或死亡。 細胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利。 隨細胞數(shù)量的增多、代謝加強，釋放CO2增多，使pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值。二氧化碳（CO2） CO2既是細胞的代謝產(chǎn)物，又是細胞生無污染及無毒直接或間接接觸的器皿、材料污染：細菌等微生物、細胞間、有害物質(zhì)無污染及無毒直接或間接接觸的器皿、材料本章小結(jié) 培養(yǎng)細胞

30、的生長方式和類型 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素本章小結(jié) 培養(yǎng)細胞的生長方式和類型細胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準備工作細胞培養(yǎng)室的設(shè)一、細胞培養(yǎng)的必備設(shè)施 無菌實驗室 超凈工作臺 恒溫培養(yǎng)箱 其他設(shè)備 （電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學顯微鏡、倒置顯微鏡、細胞液氮儲存器、離心機、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）一、細胞培養(yǎng)的必備設(shè)施 無菌實驗室無菌實驗室設(shè)計原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。組成： 更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。 緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時與 幾個操作間相通。 操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細胞培養(yǎng)， 房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。無菌實驗室設(shè)計原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)細胞培養(yǎng)技術(shù)超凈工作臺 分類側(cè)流式：氣流由左側(cè)或右側(cè)通過臺面流向?qū)?cè)直流式：氣流從上向下