分子生物學(xué)格式rnai制備sirnas的方法

1、RNAi：制備siRNAs的方法越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來(lái)抑制特定的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過(guò)程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學(xué)，藥物靶篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析等等。 目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括化學(xué)合成 體外轉(zhuǎn)錄 長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III) siR

2、NA表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá) 前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后面兩種方法則依賴能夠表達(dá)siRNAs的DNA載體或者表達(dá)框轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。哪種是最好的方法，其實(shí)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹＿@里簡(jiǎn)單介紹這5種方法，優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及它們最適合的應(yīng)用。siRNA的設(shè)計(jì) 除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計(jì)siRNA以及siRNA設(shè)計(jì)對(duì)siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來(lái)越多有關(guān)設(shè)計(jì)原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來(lái)說(shuō)，每

3、個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)34對(duì)siRNAs，在后面的實(shí)驗(yàn)中選擇最有效的那個(gè)。網(wǎng)上有提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具。體外制備1.化學(xué)合成 盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成34對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素2.

4、體外轉(zhuǎn)錄 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，是一種性價(jià)比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個(gè)還是需要DNA合成的，不過(guò)DNA合成的成本就比較低了），只要24小時(shí)就可以，不需要等很久。這個(gè)方法的不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間畢竟，化學(xué)合成只需要定購(gòu)就可以了

5、。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，圖2）最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting -Actin were prep

6、ared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambions Silencer siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 l siPORT Lipid (Ambion

7、) according to the manufacturers protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human -Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate f

8、luorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in _ 95% reduction in -actin protein levels.3.用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒”就可以避免這個(gè)缺陷。這個(gè)方法是選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用

9、體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況

10、通常不會(huì)造成影響(1-4)。Ambion公司曾經(jīng)用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關(guān)閉幾個(gè)基因，包括c-fos, GAPDH, La, -actin, 和Ku-70。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療Figure 3. Gene Silencing with the Silencer siRNA Cocktail Kit. A population of siRNAs targeting 200 nt of the Ku-70 mRNA wa

11、s prepared with the Silencer siRNA Cocktail Kit (RNase III) and transfected into HeLa cells at a final concentration of 100 nM. Cells were analyzed 48 hours later by immunofluorescence. Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.體

12、內(nèi)表達(dá) 前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門(mén)的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。4. siRNA表達(dá)載體 多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)(14)。這3類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串

13、（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾天的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。不過(guò)幸好載體容易大量擴(kuò)增，這個(gè)優(yōu)點(diǎn)足以彌補(bǔ)所有缺陷，特別是當(dāng)載體在實(shí)驗(yàn)中確實(shí)有效的時(shí)候。 毫無(wú)疑問(wèn)，siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于這是眾多方法中唯一可以進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對(duì)轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問(wèn)題。

14、最近多個(gè)廠家開(kāi)始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便。最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長(zhǎng)期研究。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作） Figure 4. Long Term Silencing of GFP with pSilencer 2.1-U6 hygro. HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected w

15、ith pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert. Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluoresc

16、ence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an empty siRNA expression vector.5. siRNA表達(dá)框架 siRNA表達(dá)框架(siRNA express

17、ion cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。這個(gè)方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中

18、構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。 這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問(wèn)題就可以解決了。另外，沒(méi)有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。 Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動(dòng)子或者人源H1啟動(dòng)子元件可供選擇，并已經(jīng)過(guò)c-fos基因抑制的檢驗(yàn)。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）Figure 5. Variable Redu

19、ction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), and human H1 (Hu-H1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of redu