實(shí)驗(yàn)1顯微鏡的使用細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色課件

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)一顯 微 鏡 的 使 用細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色(3學(xué)時(shí))實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及教材：實(shí)驗(yàn)2、7、12等。一 目的要求 1 復(fù)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和操作技術(shù)；學(xué)習(xí)油鏡的工作原理和使用方法； 2 掌握細(xì)菌的制片和簡(jiǎn)單染色技術(shù)，觀察球菌和桿菌等在光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)特征； 3 建立“無(wú)菌概念”，體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。二 實(shí)驗(yàn)器材 1 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。 2 溶液和試劑 香柏油、二甲苯、呂氏堿性美蘭染液、水等。 3 儀器和其它用品 普通光學(xué)顯微鏡、載玻片、酒精燈、火柴、擦鏡紙、接種

2、環(huán)、廢液缸、濾紙、紗布等。1 機(jī)械裝置 鏡座和鏡臂：鏡座支持整個(gè)顯微鏡，鏡臂支持鏡筒部分。 鏡筒：上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，分為單筒和雙筒兩種。 轉(zhuǎn)換器：是一個(gè)金屬圓盤，上面裝有3-4個(gè)物鏡，可以使物鏡通過鏡筒和目鏡組成一個(gè)放大系統(tǒng)。 載物臺(tái)：放置鏡檢標(biāo)本，中間有通光孔。載物臺(tái)上裝有標(biāo)本夾和標(biāo)本推進(jìn)器，在推動(dòng)器上具有刻度，能夠確定標(biāo)本位置，便于找到觀察視野。 調(diào)焦裝置： 調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本間距離的結(jié)構(gòu)。粗動(dòng)螺旋微動(dòng)螺旋2 光學(xué)系統(tǒng) 物鏡：安裝在轉(zhuǎn)換器上，將物體第一次放大，決定顯微鏡的成像質(zhì)量和分辨能力。 目鏡：安裝在鏡筒上端，由兩塊透鏡組成，將物鏡成的像再次放大，但是不增加分辨力，目鏡放大倍數(shù)過大，反

3、而影響觀察效果。 聚光器：由聚光鏡和虹彩光圈組成，調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，使適當(dāng)強(qiáng)度的光線照射到標(biāo)本上。 光源：安裝在鏡座內(nèi)，通過開關(guān)控制。 濾光片：可見光由不同波長(zhǎng)的光線組成，使用濾光片可以得到所需的一種波長(zhǎng)的光線，提高分辨率、增加反差。 油鏡的工作原理1 提高分辨率 0.5 l最小可分辨距離= n sin q 分辨率是決定顯微鏡觀察效果的重要指標(biāo)， 顯微鏡分辨率越高，能達(dá)到的最小可分辨距離越小。為所用光源波長(zhǎng)；n=載玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。 鏡口角是光線投射到物鏡上的最大角度，q為物鏡鏡口角半數(shù)，取決于物鏡的直徑和工作距離。 n：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。 顯微鏡數(shù)值孔徑(nu

4、merical aperture, NA)：指鏡口角一半的正弦與載玻片物鏡間介質(zhì)折射率的乘積，是決定物鏡性能的最重要指標(biāo)。 空氣 (n=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油 (n=1.52)，介質(zhì)折射率提高 數(shù)值孔徑值提高 分辨率提高。 0.5 l最小可分辨距離= n sin q 光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時(shí)發(fā)生折射。2 提高照明度空氣(n=1.00) 玻璃(n=1.52) 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 細(xì)菌個(gè)體微小，無(wú)色透明，不經(jīng)過染色，常常不容易觀察。經(jīng)過染色后，菌體與背景顏色形成鮮明的顏色對(duì)比，便于在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小和排列方式。 利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色的方法稱為簡(jiǎn)單染色。 用于生物染

5、色的堿性染料不是堿而是一種鹽，堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電荷，而細(xì)菌蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液時(shí)常帶負(fù)電荷，這樣帶負(fù)電荷的細(xì)菌很容易與帶正電荷的染料離子結(jié)合而使細(xì)菌著色。 常用的堿性染料有美蘭、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅等。室溫或烘干1小滴生理鹽水四 操作步驟 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 涂片干燥固定染色水洗鏡檢2-3次美蘭，2-3min濾紙吸干瞳 距 調(diào) 節(jié)屈光度調(diào)節(jié)：可以適應(yīng)雙眼視力有差異的觀察者。2 低倍鏡觀察 養(yǎng)成良好的調(diào)焦習(xí)慣，先從側(cè)面注視，小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀察，以防操作失誤而損壞鏡頭。3 高倍鏡觀察 一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器將

6、其它物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，物像保持基本準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)，稱為物鏡的同焦(parfocal)。 利用同焦現(xiàn)象，在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時(shí)，僅用微動(dòng)螺旋即可對(duì)物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗動(dòng)螺旋時(shí)可能的錯(cuò)誤操作而損壞鏡頭。4 油鏡觀察 注意不要因?yàn)樵谙陆滴镧R鏡頭時(shí)用力過猛或者調(diào)焦時(shí)誤將粗動(dòng)螺旋向反方向轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭及載玻片。 不可以將高倍鏡轉(zhuǎn)動(dòng)經(jīng)過加油鏡油的區(qū)域。5 顯微鏡用畢后處理 下降載物臺(tái)，取下載玻片；分三步用擦鏡紙清理鏡頭。 將顯微鏡還原。包括將光源燈亮度調(diào)至最低后關(guān)閉；將最低放大倍數(shù)物鏡轉(zhuǎn)到工作位置；載物臺(tái)及聚光器降至最低位置。五 注意事項(xiàng) 1 嚴(yán)格、標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行無(wú)菌操作。 2 涂片時(shí)取菌量要適宜而且要涂抹均勻。