感受態(tài)細(xì)胞的制備

1、LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl,1%（亞/丫），用固體NaOH調(diào)節(jié)pH為7.07.2,分裝于三角瓶中，滅菌后存于室溫。搖動(dòng)三角瓶，如果發(fā)現(xiàn)變渾濁，表明已染菌，應(yīng)棄掉重新配制；0.1mol/LCaCl2：稱取1.47gCaCl22H20（Amresco分裝）溶于100mL去離子水中，滅菌后存于4；離心管（50mL或80mL或100mL），滅菌；培養(yǎng)試管，滅菌；1mL槍頭，滅菌；1mL加樣槍；濾紙，用牛皮紙包好后滅菌；10mL量筒，滅菌；5mL移液管，用棉花塞入管口，卷于報(bào)紙中滅菌；冰，離心管架；恒溫?fù)u床，可見分光光度計(jì)，玻璃比色杯。.接種空白大

2、腸桿菌于3mLLB培養(yǎng)基中，37劇烈震蕩培養(yǎng)過夜；.將已培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入100mLLB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD650=0.3后，將培養(yǎng)好的細(xì)菌置于冰上冷卻10min；.4,4000rpm離心10min收集細(xì)菌，倒出上清，將離心管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基控干；.用40mL冰預(yù)冷的CaCl2懸浮細(xì)菌，用加樣槍沖吸，使菌體盡可能分散。冰上放置30min；.4,4000rpm離心10min收集細(xì)菌，倒出上清，再用4mL冰預(yù)冷的CaCl2懸浮細(xì)菌，這些細(xì)菌可以立即使用，或者于4放置1224h以增加其敏感性后使用。.如果證明所制備的感受態(tài)細(xì)胞可用，可以在冰上分裝為100L每管，再加入100L甘油（注意

3、：甘油非常黏稠，吸取時(shí)應(yīng)該多一點(diǎn)。），于液氮或-70冰箱中存放。存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞，一定不能融解。如果已經(jīng)融解，應(yīng)丟棄，而不能再凍結(jié)保存而繼續(xù)使用。.本實(shí)驗(yàn)室所用空白大腸桿菌菌株為1乂109?？瞻拙梢杂谄桨迳蟿澗€后，用Parafilm包好后存于4,也可將液體培養(yǎng)物存于4。但如果要長(zhǎng)期保存，則應(yīng)將細(xì)菌保存于50%的甘油中，存于-20或-70。當(dāng)接種的細(xì)菌是來自于-20或-70存放的液體培養(yǎng)物時(shí)，接種應(yīng)迅速，不等解凍，立即從表面刮下一塊冰后，將菌種迅速放回低溫存放；.一般于3mLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12h后，菌體已很濃，可以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。于100mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)23h后，即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

4、但有時(shí)如果由于存放過久，或者已經(jīng)過數(shù)次解凍，造成細(xì)菌生活力下降，則倍增時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)；.對(duì)OD值的監(jiān)測(cè)，當(dāng)肉眼看到菌體已很濃時(shí)，于超凈臺(tái)上取3mL測(cè)OD值。開始可以每30分鐘檢測(cè)一次，越到后面檢測(cè)的時(shí)間就應(yīng)該縮短；.感受態(tài)細(xì)胞的制備應(yīng)該再嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行。因此，所有操作均應(yīng)在超凈臺(tái)上。也可以在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行，但應(yīng)在后面放一酒精燈，所有操作都不能遠(yuǎn)離火焰。最好每次恰好做感受態(tài)之前，將所有的槍頭和管子都滅一下菌，用酒精棉球?qū)⒓訕訕尩那岸瞬潦靡槐椋?感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜比較脆弱，因此一當(dāng)用冰冷的CaCl2懸浮以后，即不能劇烈震蕩或快速抽吸；.根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，純度較高的含結(jié)晶水的CaCl2可以得到好的實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)果；.所有的槍頭和管子均應(yīng)干凈。如果有可能，都盡量用新的。如果是用的回收的槍頭，一定要看管壁是否干凈。.擴(kuò)大培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基體積可以調(diào)整。調(diào)整后的CaCl2溶液體積也按比例作相應(yīng)的放大或縮小。.以本方法制備的感受態(tài)細(xì)胞的感受效率將隨低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，所以最好是現(xiàn)做現(xiàn)用。存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該在一個(gè)月內(nèi)使用。而對(duì)于轉(zhuǎn)化PCR連接產(chǎn)物，建議用其它的感受效率更高的制備方法。本節(jié)后的附4介紹了一種高感受效率感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化LB液體培養(yǎng)基：見感受態(tài)細(xì)胞的制備；LB固體培養(yǎng)基：于液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉。不用在滅菌前溶化瓊脂粉，滅菌完后，輕輕搖勻。注意不能劇烈

6、搖動(dòng)，否則可能會(huì)使培養(yǎng)基暴沸；LB平板:將滅菌后的固體培養(yǎng)基冷至60左右時(shí)，倒入90mm的培養(yǎng)皿中（約30mL。如果先前已加入了抗生素，則還應(yīng)在超凈臺(tái)上晃動(dòng)培養(yǎng)皿幾次；200L槍頭，1.5mLEp管，滅菌；42水??；10L，200L加樣槍；培養(yǎng)試管，滅菌；恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；菌液推棒；抗生素儲(chǔ)液，本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類，氨卞青霉素（Amp）（儲(chǔ)液，100mg/mL，溶于無菌水中，工作濃度100g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1L儲(chǔ)液）；四環(huán)素（Tet）（儲(chǔ)液，5mg/mL，先用1/2體積的乙醇溶解，再加入1/2體積的無菌水，工作濃度50g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全

7、部于-20保存）；冰；1如果是凍存的感受態(tài)細(xì)胞，先于冰上溶解；.加入用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒A1L；3冰上放置30min；.于42熱擊60s；.迅速放于冰上，5min后進(jìn)行下一步；.將已攝取了外源遺傳物質(zhì)的感受態(tài)細(xì)胞加入培養(yǎng)試管，該培養(yǎng)試管有已預(yù)熱至37的LB液體培養(yǎng)基，使總體積為1m，溫和震蕩（200rpm左右）培養(yǎng)1h；7,將復(fù)蘇的培養(yǎng)物倒入一Ep管中，4，4000rpm離心10min，將培養(yǎng)基倒掉，用殘留的培養(yǎng)基懸浮，然后用加樣槍將菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培養(yǎng)基表面無可見的液體，將有培養(yǎng)基的一面向下培養(yǎng)約30min后，倒置培養(yǎng)過夜。1熱擊時(shí)間要根據(jù)所用管子的傳熱效率，薄壁管子的傳熱效率高

8、，熱擊時(shí)間可以縮短到45s；2熱擊時(shí)，要使水浴盡可能不要流動(dòng)，熱擊后應(yīng)迅速放回冰上；3于37復(fù)蘇細(xì)菌時(shí)，不能加抗生素，搖動(dòng)也不能太過于劇烈；4.對(duì)照的設(shè)置對(duì)于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化結(jié)果非常重要，將10L感受態(tài)細(xì)胞分別涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受態(tài)細(xì)胞沒有問題，則應(yīng)該在不含抗生素的平板上生長(zhǎng)，而在含有抗生素的平板上不能生長(zhǎng)。5一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用其中的1/3涂布一個(gè)平板，2/3涂布一個(gè)平板。不過，對(duì)于多拷貝質(zhì)粒，也可以不用離心，取50L涂布一個(gè)平板足矣。質(zhì)粒DNA的提取儲(chǔ)液：100mL1mol/LTris-HCl(pH8.0):稱取Tris12.1g,用濃HCl調(diào)節(jié)pH為8.0,然后定溶至10

9、0mL,滅菌后存于4；100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)稱取18.6g二水乙二胺四乙酸二鈉，加80mL去離子水，加熱溶解，用固體NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0,然后定溶至100mL,滅菌后存于4；100mL10%SDS,稱取10g十二烷基硫酸鈉于80mL去離子水中，加熱溶解后存于室溫;2mol/LNaOH10mL,稱取0.8g固體NaOH溶解，定溶至10mL,于塑料瓶中室溫存放,可以不滅菌。溶液I：每配制100mL,稱取葡萄糖0.9g(50mmol/L),1mol/LTris-HCl(pH8.0)2.5mL(25mmol/L),0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL(10mmol

10、/L),定溶至100mL,滅菌后存于4；溶液II：現(xiàn)用現(xiàn)配，每100L需要2mol/LNaOH10L(0.2mol/L),10%SDS10L(1%),然后加80L無菌水；溶液III：每100mL稱取KAc49.1g,于70mL去離子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5mL,定溶至100mL后，滅菌存于4；TE(pH8.0)：每100mL取1mol/LTris-HCl(pH8.0)儲(chǔ)液1mL(10mmol/L)，0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL(1mmol/L)定溶至100mL后，滅菌存于4；無DNase的RNaseA：WRNaseA溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)

11、,15mmol/LNaCl中，使終濃度為10mg/mL,于100加熱15分鐘，緩慢冷至室溫，然后存于-20；Tris飽和酚(pH8.0)；氯仿/異戊醇(24：1)；100%乙醇與70%乙醇，均于-20存放；1.5mLEp管，200L及1mL槍頭，滅菌；40L，200L，1mL加樣槍；濾紙，1.5mLEp管；冰；.接種一單菌落于3mL含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)試管中，于37劇烈振蕩培養(yǎng)過夜；.將全部培養(yǎng)物分兩次倒入1.5mLEp管中,12000g離心1min收集細(xì)胞；.將Ep管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基盡可能流盡；.將細(xì)菌沉淀重懸于200l冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩使細(xì)菌沉淀分散；.加400L新配制的

12、溶液II,蓋緊管口，輕柔的快速顛倒Ep管510次，然后將Ep管于冰上放置5min；.加300L用冰預(yù)冷的溶液III,蓋緊管口，將Ep管顛倒混合15次左右，然后將Ep管于冰上放置5min；.2,12000g離心5min,將上清轉(zhuǎn)入另一Ep管，加等體積的酚/氯仿，振蕩混勻，2,12000g離心5min；.吸出上清,再加等體積的氯仿抽提；.在吸出的上清中加入2倍體積冰冷的乙醇于室溫沉淀2min；.2,12000g離心5min,倒出上清，沉淀用70%乙醇洗兩次。然后倒置于一濾紙上，讓乙醇揮發(fā)干凈；.高拷貝質(zhì)粒溶于含5LNA的50TE中；低拷貝數(shù)質(zhì)粒減半。.細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般以1216h為宜，如

13、果培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，培養(yǎng)物會(huì)非常粘稠，這會(huì)導(dǎo)致離心沉淀的困難；2一般細(xì)菌培養(yǎng)好以后，應(yīng)該馬上提取。如果不能馬上提取，于4存放時(shí)間不能過長(zhǎng)；.加溶液I分散細(xì)菌沉淀比較關(guān)鍵，如果分散不好，將直接影響產(chǎn)率；.溶液I加入后，溶液會(huì)非常渾濁，加入溶液II顛倒幾次后，溶液變清，打開管口，會(huì)發(fā)現(xiàn)溶液呈鼻涕樣，加入溶液III顛倒后，會(huì)發(fā)現(xiàn)有沉淀物形成，該沉淀物位于溶液上層。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不能自動(dòng)聚集，而是呈爛棉花狀，且離心后不能沉到管底，則預(yù)示著實(shí)驗(yàn)的失??；4培養(yǎng)基的成分非常復(fù)雜，如果去除得不太干凈，則有可能影響到后面的酶切效果；5乙醇必須去除干凈，否則會(huì)造成電泳點(diǎn)樣時(shí)上漂；但樣品又不能干燥太久，否則有可能使得質(zhì)粒

14、DNA沉淀難于溶解在TE中。.SDS在低溫下會(huì)析出結(jié)晶，因此配制溶液II時(shí)應(yīng)先于60溶解；.如果一次要提多個(gè)樣品，可以先一起配制溶液II,而后加入每管。但配制時(shí)應(yīng)略大于所需要的量；EJM109或其它菌種LB液體培養(yǎng)基50mL離心管LB固體培養(yǎng)基LB平板200L槍頭，1.5mLEp管，滅菌;42水浴；10L,200L加樣槍；培養(yǎng)試管，滅菌；恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；菌液推棒；抗生素儲(chǔ)液，本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類，氨卞青霉素（Amp）（儲(chǔ)液，100mg/mL,溶于無菌水中，工作濃度100g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1L儲(chǔ)液）；四環(huán)素（Tet）（儲(chǔ)液，5mg/mL，先用1/2體積的乙醇溶解

15、，再加入1/2體積的無菌水，工作濃度50g/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全部于-20保存）；冰；SOB培養(yǎng)基(1L);蛋白胨20g,酵母抽提物5g,NaCl0.58g,KCl0.38g,100義鎂離子母液(每100mL含MgCl26H2O20.33g,MgSO47H2O24.65g)10mL。用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0。SOC培養(yǎng)基：SOB+20mmol葡萄糖（每100mLSOB培養(yǎng)基中加入50%的葡萄糖溶液720L。)0.5mol/LCaCl2：7.35gCaCl22H2O溶于100mLddH2O中。用0.22m的微孔濾膜過濾除菌。1mol/LKCl：7.45gKCl溶于

16、100mLddH2O中，高壓滅菌。0.45mol/LMnCl2；8.9gMnCl24H2O溶于100mLddH2O中，高壓滅菌。0.5mol/L(K-MES)：9.76g2(-N-嗎啡啉)乙磺酸溶于約80mLddH2O中，用KOH調(diào)pH為6.2，加水定容至100mL,用0.22m的微孔濾膜過濾除菌。分裝后于-20oC保存。二甲基亞砜(DMSO)。TB緩沖液：10mmol/LK-MES(pH6.2)(0.5mol/LK-MES(pH6.2)2mL),45mmol/LMnCl2(0.45mol/LMnCl210mL,15mmol/LCaCl2(0.5mol/LCaCl23mL),250mmol/L

17、KCl(1mol/LKCl25mL)ddH2O60mL。(用上述已經(jīng)滅菌的母液配制,容量瓶事先也應(yīng)滅菌。)超凈工作臺(tái)，電熱恒溫水浴，分光光度計(jì)，離心機(jī)。.接種一環(huán)E.coliJM109于2mLSOB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜；或者將低溫下保存的E.coli解凍后，于LB平板上劃線。.取0.5mL過夜培養(yǎng)物或挑一個(gè)單菌落于50mLSOB中，于18搖床中培養(yǎng)16-24h至OD600值達(dá)到0.6。.取出搖瓶置于冰浴中10min,轉(zhuǎn)入50mL離心管中，4000rpm離心10min,棄上清液，將菌體懸浮于16mL預(yù)冷的TB緩沖液中，再置于冰浴中10min后離心收集菌體。.將菌體重新懸浮于4mLTB緩沖液中，加入280pLDMSO使其終濃度為7%,并輕輕搖勻，冰浴至少10min,將感受態(tài)細(xì)胞分裝入EP管中并置于液氮中冷凍5min以上（此時(shí)的感受態(tài)細(xì)胞可于液氮中保存40天以上而不影響轉(zhuǎn)化頻率）。.取出EP管讓其在冰浴