2022執(zhí)業(yè)藥師考試綜合輔導：胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤

1、2022執(zhí)業(yè)藥師考試綜合輔導：胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤胞嘧啶脫氨酶基因?qū)肽[瘤細胞可將無毒性的原藥在腫瘤細胞內(nèi)代謝為具細胞毒的產(chǎn)物而發(fā)揮抗腫瘤效應。本文綜述了該基因的克隆、作用機制和在消化道腫瘤治療中的討論進展。隨著分子生物學的迅猛進展，基因治療這一嶄新方法盡管還多處于試驗討論手段，卻已顯示出良好的應用前景。自1991年Huber等提出病毒導向的酶解原藥療法以來，有關(guān)的基因討論成為熱門課題。目前，一個新的基因治療系統(tǒng)EC-CD/5-FC系統(tǒng)正日益受到高度關(guān)注。本文就胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤的現(xiàn)狀作一綜述。CD基因的克隆胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動物細胞中不含該酶

2、。Austin等于1992年首先從大腸桿菌株中采納傳統(tǒng)方法提取質(zhì)粒DNA,進一步分別、純化并轉(zhuǎn)染宿主菌，初步構(gòu)建成原核細胞中表達的CD質(zhì)粒載體，克隆了編碼CD的大腸桿菌基因，利用陽性基因篩選方法，獲得一攜帶10.8kb的DNA插入質(zhì)粒，其中一 3kb的DNA片段保存有CD酶活性。CK蛋白質(zhì)分子量為52022, DNA序列分析顯示一含427個氨基酸開放讀碼框架編碼CD。為證明CD基因在真核細胞中表達以發(fā)揮作用，討論者采納寡核昔酸突變技術(shù)，將CD基因起始密碼子由GTG-ATG,從而產(chǎn)生一 5起始密碼子，選擇pRc/CMV真核表達載體，構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pCMV/CD-1。以脂質(zhì)體法將pCMV/CD

3、-1導入人結(jié)腸癌WiDr細胞系，生長抑制試驗顯示轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細胞對5-FC的IC50為30umol,而未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞其IC50為17000 umol,說明轉(zhuǎn)染有CD基因的結(jié)腸癌細胞對5-FC的敏感性提高了近560倍。CD基因轉(zhuǎn)移方法安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法是基因治療的關(guān)鍵因素之一。至今，作為基因轉(zhuǎn)移的載體，以病毒性載體介導的方法討論最為系統(tǒng)深入，幾乎應用于全部的靶系統(tǒng)。在消化道腫瘤的CD基因治療中，既往的討論仍選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這與對其基因組構(gòu)造和生活周期了解得較清晰有關(guān)。RV載體大多由Moloney小鼠白血病病毒構(gòu)建而成，為RNA病毒，基因組編碼在一條單鏈RNA分子上，進入細胞后，逆轉(zhuǎn)

4、錄成雙鏈DNA,此DNA進入細胞核整合在受體細胞DNA上，并以此為模板合成病毒基因和后代RNA。采納RV轉(zhuǎn)導CD基因，將CD基因整合于病毒長末端重復的最末端，因而整合后的病毒基因構(gòu)造可受到愛護不致受損。目前轉(zhuǎn)導CD基因多項選擇擇腺病毒載體。由于腺病毒為一雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣泛，尤其能有效地感染非分裂狀態(tài)的細胞，另外，它不能整合到宿主細胞染色體上，因而較逆轉(zhuǎn)錄病毒更為安全。重組腺病毒載體主要來自于2型和5型腺病毒，容量大，可裝載達7.6kb。已有學者選用Ad載體介導CD基因轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT29細胞系，將攜帶有大腸桿菌標記基因的腺病毒注射到腫瘤組織中底物X-gal染色來推斷基因轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果

5、顯示外源基因經(jīng)單次注入后近5%-30%的腫瘤組織表達Lacz基因。作用機制由于哺乳動物細胞中不存在CD，因而不能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶。但通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將CD基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞，則哺乳動物細胞可將一些原來無毒性的原藥轉(zhuǎn)化為有細胞毒性的代謝產(chǎn)物，導致細胞自殺性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的濃度下對哺乳動物無毒性作用，經(jīng)CD脫氨為5-FU，后者則具有高度細胞毒性，為臨床廣泛使用的抗腫瘤化療藥物。CD基因作用的一個非常突出特點即所謂的“旁觀者效應，這與某些自殺基因的作用機制相像。Hirschowitz等最早觀看到CD基因治療結(jié)腸癌時的這一效應，當CD+的

6、結(jié)腸癌細胞與CD-的結(jié)腸癌細胞混合時，比擬了 CD+的細胞比例為10%和100%時兩者的細胞生長抑制水平，結(jié)果無顯著性差異。對旁觀者效應尚缺乏準確的解釋，但大多同意“縫隙連接引起旁觀者效應，通過細胞間的接觸，毒性代謝產(chǎn)物由“縫隙連接從CD+的細胞轉(zhuǎn)入CD-的細胞，從而使得后者變得原藥也敏感了，并被原藥代謝產(chǎn)物殺死。但亦有學者提出不同意見，Trinh等通過電鏡發(fā)覺在腫瘤組織鄰近區(qū)域有大量的“橋粒存在，因其起著封閉細胞間轉(zhuǎn)運的作用，推想旁觀者效應并非上述機制，尚有其它機制參加，如細胞凋亡、原藥代謝產(chǎn)物本身可穿過細胞膜等可能機制。幾種消化道腫瘤CD基因治療現(xiàn)狀結(jié)腸癌CD基因治療的討論對象以結(jié)腸癌為多

7、。Huber等觀看到*鼠5-FC的半衰腸期大約是40分鐘，腹腔內(nèi)賜予500mg/的5-FC,其血漿水平可維持在4000 u molo體外試驗顯示：對于CD+結(jié)腸癌細胞，5-FC的IC50僅為5umol；而體內(nèi)試驗結(jié)果說明無論是腹腔內(nèi)還是靜脈內(nèi)賜予5-FC，都同樣觀看到明顯的抗腫瘤效應。Richard等將組織特異性因子癌胚抗原轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的三個局部分別插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，構(gòu)建了 一系列pCEA/CD基因載體，通過分析熒光素活性，篩選出活性的pCEA/CD-145基因。體外試驗將其轉(zhuǎn)導入大腸癌NCIH508細胞中，在5-FC存在下，基因表達發(fā)揮出良好的原藥轉(zhuǎn)換抗腫瘤效應，CD+

8、的NCIH508細胞其IC502umol,而CD的NCIH508細胞其IC50達516umol0體內(nèi)試驗比擬轉(zhuǎn)導前后的大腸癌細胞*鼠體內(nèi)成瘤后，賜予5-FU500 ug(kgd,)，連續(xù)20日，細果顯示未轉(zhuǎn)導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量增加了近3倍，而轉(zhuǎn)導CD的大腸癌細胞成瘤*鼠腫瘤重量根本未轉(zhuǎn)變。肝腫瘤肝原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的基因治療討論報道最多。由于肝臟是結(jié)腸癌最常轉(zhuǎn)移的部位，因此，Ohwada等在建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的根底上，賜予人結(jié)腸癌荷瘤*鼠肝內(nèi)注射AdCMV.CD和腹腔內(nèi)每周二次賜予5-FC,以點雜交分析肝內(nèi)人結(jié)腸癌細胞DNA數(shù)量來推斷抑制轉(zhuǎn)移瘤效果。結(jié)果與對比組相比，治療組肝內(nèi)

9、人結(jié)腸癌細胞DNA數(shù)量顯著低于各對比組，級組織學檢查顯示治療組注射部位肝腫瘤消失壞死，對比組未見此現(xiàn)象，且治療組中正常肝組織僅見稍微的、可恢復的炎癥，未見壞死。最近，Kanai等報道選擇甲胎蛋白啟動子/增加子，構(gòu)建重組腺病毒載體AdAFP-CD和AdAFP-Lacz,分別轉(zhuǎn)染AFP+的肝癌細胞系和AFP-的肝癌細胞系，結(jié)果顯示：在前者，目的基因轉(zhuǎn)移效率顯著提高，5-FC的IC50為136.6umol,而后者的 IC50 達 24651 u molo胰腺癌癌基因ERBB2在多種腫瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈高表達，而在正常和炎癥胰腺組織未見這種高表達，因此,Harris等以ERBB2轉(zhuǎn)錄

10、調(diào)整序列中一含544個堿基對的DNA片段啟動CD基因，選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞HPAF、Panel和乳腺癌細胞T3M4, HPAF細胞呈高表達、Panel細胞呈中度表達、而T3M4細胞不表達ERBB2。檢測結(jié)果說明未轉(zhuǎn)染的上述三種細胞檢測不出CD酶活性，而轉(zhuǎn)染后其CD酶活性分別為每分鐘958.3、344.5和0pmol/109每分鐘109細胞產(chǎn)生尿嘧啶的微摩爾量。在前兩組，賜予5-FC后，轉(zhuǎn)染CD的胰腺癌細胞生長明顯受抑，而在T3M4組，細胞生長則未見明顯轉(zhuǎn)變。近來，Evoy等報道選用腺病毒載體，勝利將CD基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，同樣在體內(nèi)、體外觀看到明顯的抗腫瘤效應。胃癌大約40%的胃癌

11、表達CEA, Lan等采納CEA啟動子作為靶向性因子，構(gòu)建了重組病毒載體AdCEA-Lacz和AdCEA-CD,分別轉(zhuǎn)染CEA陽性胃癌細胞系MKN45、MKN28和CEA陰性胃癌細胞MKN1,體內(nèi)和體外試驗顯示Lacz基因選擇性只在CEA陽性胃癌細胞中表達；另外，AdCEA-CD轉(zhuǎn)導后上述三類細胞對5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分別是88.307和16935umol,細胞對5-FC的敏感性分別提高了 73、267和1.1倍。結(jié)語無論是RV還是Ad載體，均不是最抱負的基因轉(zhuǎn)移載體，設計安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是基因治療討論中急待解決的問題；另外，綜觀某些文獻，對比組設置均為各種腫瘤細胞，缺乏腫瘤細胞與骨髓細胞、腸上皮細胞和生殖細胞等化療藥物敏感組織細胞的比擬，討論基因治療腫瘤的目的不是為了比擬各種腫瘤細胞間的差異，而應比擬腫瘤與癌旁組織和其它正常組織細胞間的差異；再者，某些體內(nèi)試驗結(jié)果尚難確定其對試驗性腫瘤具有治療作用亦或預防作用。盡管如此，現(xiàn)有的討論