親和純化的技術(shù)

1、關(guān)于親和純化技術(shù)第1頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四2第九章 親和純化技術(shù)親和純化技術(shù)（Affinity purification）:利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)“親和力”第2頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四3親和純化技術(shù)親和層析(Affinity chromatography) 親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）第3頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四4第一節(jié) 親和層析(Affinity Chromatography)第

2、4頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四5親和層析第5頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四6第一節(jié) 親和層析(Affinity Chromatography)（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。（2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì).（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。 第6頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四7一、親和層析的原理和特點(diǎn)7利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的層析技術(shù)。 適用于從成份復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物

3、。經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質(zhì) ；特異性強(qiáng)、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。第7頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四8親和吸附劑：載體配基在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand）。與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）。第8頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四9配基-底物（Ligand-substance）配基-底物：親和對特異性好 通用性差第9頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四10梁山伯朱麗葉楊貴妃小龍女祝英臺林黛玉崔鶯鶯Ligand Substance祝英臺第10頁

4、，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四11酶受體，載體蛋白凝集素抗原，病毒，細(xì)胞谷胱甘肽聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp殘基核酸互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，核酸結(jié)合蛋白金屬離子谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，GST融合蛋白抗體多糖類，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞激素，維生素底物類似物，抑制劑，輔助因子底物 配基 第11頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四12二、載體（一）、親和層析對載體的要求：第12頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四13（二）、常用載體 第13頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四141

5、、纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強(qiáng)，空間位阻。主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。 第14頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四152、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。Sepharose CL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH314中應(yīng)用。 第15頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四16 3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。 第16頁，共47頁，20

6、22年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四174、聚丙烯酰胺凝膠： Bio-gel P有供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。 pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。第17頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四18 5、多孔玻璃珠：化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高。缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，化學(xué)活性基團(tuán)少。第18頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四196、其它載體殼聚糖(Chitosan)甲殼素和殼聚糖殼聚糖是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物第19頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分

7、，星期四20三 、 親和配基 第20頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四21（一）、配基的選擇 第21頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四22（二）、配基的濃度 對親和勢比較低的系統(tǒng)（KL10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難。可以通過增加親和柱的長度來提高吸附率。第22頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四23（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時(shí)，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，

8、對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。例：第23頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四24（四）、配基分子的大小 選用大分子配基。小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。第24頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四25四、 載體的活化與偶聯(lián) Q:載體在于配基偶聯(lián)前為什么要“活化”？ A：載體相對“惰性”，不能直接與配基連接（不容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)），因此在偶聯(lián)前（載體與配基對接），需要對載體進(jìn)行“活化”活化的方式有很多種第25頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四26載體的活化的方式多糖類載體第26頁，共47頁，202

9、2年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四27聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法酰胺基 + 含氮化合物 胺衍生物第27頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四28五、 影響吸附親和力的幾個因素 第28頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四29六、 配基與間隔臂的連接 （一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接第29頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四30七、 親和層析的吸附和洗脫 第30頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四31第31頁，共47頁，2022年，5月

10、20日，18點(diǎn)23分，星期四32（一）、影響吸附的條件 1、親和吸附劑及配體的性質(zhì)緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH、溫度和層析流速有關(guān)。2、溫度升高會使吸附作用減弱。3、流速每小時(shí)低于10 ml/cm2。4、上樣體積為柱床體積的5%。第32頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四33第33頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四34離子效應(yīng) 配基與載體-間隔臂的不完全結(jié)合，將無關(guān)離子基團(tuán)引入吸附劑。具有離子基團(tuán)的親和吸附劑會影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。第34頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四35疏水基團(tuán)吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互

11、吸引，形成非專一性吸附。疏水基團(tuán)：（1）長的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂”：烴鏈（2）疏水性配基第35頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四36復(fù)合親和力離子效應(yīng)作用，又有疏水作用。提高選擇性對每一具體系統(tǒng)找出最佳的配給濃度、pH、離子強(qiáng)度和溫度。第36頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四37（二）、親和層析的洗脫第37頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四38非專一性洗脫改變洗脫劑的pH以影響電性基團(tuán)的解離程度離子強(qiáng)度的分步和梯度變化降低緩沖液極性第38頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四39特殊洗脫斷裂方法有：硫酯鍵用

12、羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。第39頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四40專一性洗脫競爭性效應(yīng)正洗脫非競爭性效應(yīng)不能達(dá)到洗脫目的反競爭性效應(yīng)負(fù)洗脫第40頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四41專一性洗脫競爭性效應(yīng)，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第41頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四42專一性洗脫非競爭性效應(yīng)，即ESI穩(wěn)定性與EI相同，I的存在不影響E對S的結(jié)合，用I不能達(dá)到洗脫的目的。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第42頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四43專一性洗脫反競爭性效應(yīng)，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結(jié)合更緊密。增加了酶與配基的結(jié)合力及親和吸附的選擇性將I除去“負(fù)洗脫”第43頁，共47頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)23分，星期四44反競爭性效應(yīng)第44頁，共47頁，2022年，