GS和GOGAT酶活性測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（修改中勿動(dòng)）9 月8 日 張青谷氨酰胺合成酶（GS）活性測(cè)定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，在ATP和Mg2+存在下, 它催化植物體內(nèi)谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應(yīng)體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為丫一谷氨 ?；惲u肟酸，進(jìn)而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在 540nm 處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。谷氨酰胺合成酶活性可用產(chǎn)生的Y谷 氨酰基異羥肟酸與鐵絡(luò)合物的生成量來(lái)表示，單位ymolmg-iproteimh-i。也可 間接用540nm處吸光值的大小來(lái)表示，單位Amg-i proteimh-i。【儀器與用具】冷凍離心機(jī)；分光光度計(jì)；天平；研缽；恒溫水浴；剪刀

2、；移液管2ml、1ml）。 【試劑】提取緩沖液：0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，內(nèi)含 2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L 蔗糖。 稱取 Tris （三羥甲基氨基甲烷）1.5295g, 0.1245g MgSO47H2O, 0.1543g DTT （二 硫蘇糖醇）和34.25g蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HCl （0.1mol/L = 1ml 的36%38%濃鹽酸加入到100ml去離子水里）調(diào)至pH8.0,最后定容至250ml； 反應(yīng)混合液A （0.1mol/L Tris-HCl緩沖，pH7.4）以加入i.6mi反應(yīng)混合液a的為對(duì)照

3、。 內(nèi)含 80mmol/L Mg2+， 20mmol/L 谷氨酸鈉鹽，20mmol/L 半胱氨酸和 2mmol/L EGTA，稱取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO47H2O, 0.8628g 谷氨酸鈉鹽，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去離子水溶解后，用0.1mol/L HCl調(diào)至pH7.4，定容 至 250ml；反應(yīng)混合液B （含鹽酸羥胺，pH7.4）：反應(yīng)混合液A的成分再加入80mmol/L鹽酸羥胺，pH7.4； 顯色劑（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3 和 0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯

4、乙酸），10.1021g FeCl36H2O,去離子水溶解后，加5ml濃鹽 酸，定容至 100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去離子水中（臨用前配制）?！痉椒ā看置敢禾崛?稱取植物材料3 穗（ 大約 12粒左右，記錄重量）于研缽中， 加3ml提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中，4C下15,000g離心 20min,上清液即為粗酶液。 反應(yīng)1.6ml反應(yīng)混合液B,加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混勻，于37C下保溫半小時(shí)，加入顯色劑1ml,搖勻并放置片刻后，于5,000g下離心10min,取上清液測(cè)定540nm處的吸光值，以加入1.6m

5、l反應(yīng)混合液A的為對(duì)照。粗酶液中可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定 取粗酶液0.5ml,用水定容至100ml,取1ml用 考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)28）-需要補(bǔ)完。4原始數(shù)據(jù)記載5.結(jié)果計(jì)算：GS 活力（A mg -1 proteimh -1）= 式中 A540nm 處的吸光值； P粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V反應(yīng)體系中加入的粗酶液體積（ml）； T反應(yīng)時(shí)間（h）。GOGAT活性測(cè)定材料與方法（紅色字樣為實(shí)驗(yàn)藥品，口標(biāo)注為藥品配置方法）一修改用 粗酶液提取同GS。【試劑】1提取緩沖液：【 0.05mol/L Tris-HCl ， pH8.0 ，內(nèi)含 2mmol/L Mg2+ ，

6、 2mmol/L DTT， 0.4mol/L 蔗糖。稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）1.5295g, 0.1245g MgSO47H2O, 0.1543g DTT （二硫蘇糖醇）和34.25g蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HC1 （0.1mol/L = 1ml 的 36%38%濃鹽酸加入到 100ml 去離子水里）調(diào)至 pH8.0，最后定容至250ml； 20 mmol/ L 的 a-酮戊二酸， 10 mmol/ L 的 KCl20mmol/ L的L-谷氨酰胺以不含l-谷氨酰胺 （glutamine ）的反應(yīng)液為對(duì)照3 mmol/ L NADH （便用之前配置）5 （需要核查）

7、25 mmol/L的Tris - HCl緩沖液（pH 7.6）【稱量三羥甲基氨基甲烷（Tris） 0.757125g,并用PH指示劑以及0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)整PH值至7.6,再定容 至 250ml】方法】實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備35 度水浴鍋和 100度水浴鍋各一個(gè)。粗酶液提取 稱取植物材料3 穗（ 大約 12 粒左右，記錄重量）于研缽中，加3ml提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中，4C下15,000g 離心20min，上清液即為粗酶液。測(cè)試樣品和對(duì)照都加入0.3 mL酶液與0.5 mL 20 mmol/ L的a-酮戊二 酸和0.1 mL 10 mmol/ L 的 KCl 和0.2 mL 3

8、 mmol/ L NADH,然后測(cè)試 樣品加入0.4 mL 20mmol/ L 的 L-谷氨酰胺 （以不含l-谷氨酰胺（guamine）的反 應(yīng)液為對(duì)照） 注：配完后，總體積3.0 mL,不足部分用25 mmol/L的Tris -HCl緩沖液（pH 7.6）補(bǔ)足（測(cè)試樣品補(bǔ)1.5mL,對(duì)照補(bǔ)1.9mL）。于30C的 水浴中保溫30 min后，于沸水中殺死酶活性30 s,于340 nm處讀取吸光 度，以不含L-谷氨酰胺（glutamine）的反應(yīng)液為對(duì)照。酶活性用氧化的NADH量（以O(shè)D34o值減少量表示）來(lái)計(jì)算GOGAT的活 力，以30C每1 h減少zOD34o等于0. 01為1個(gè)酶活性單位，最后依 據(jù)樣品籽 粒數(shù) 和稀釋倍數(shù)計(jì)算酶的活性，單位為 unit/(grain *h)附注：Tris-hcl 配置方法：Tris-HCI 緩沖液(0.05 mol/L)50毫升0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與X毫升0.1mol/L鹽酸混勻并稀釋至100 毫升。pH (25C) X (mL) TOC o 1-5 h z 45.744.743.44