202x年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題-分解尿素的細(xì)菌的分離

1、課題2土壤中分解(fnji)尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)第一頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件一、課題(kt)背景1、尿素(nio s)的利用 尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后(zhhu)才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+ CO22NH3+ H2O第二頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件4、課題(kt)目的從土壤(trng)中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟(jijng)含有多少這樣 的細(xì)菌第三頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件一.研究(ynji)思路.篩選(shixun)菌株.統(tǒng)計(jì)(tngj)菌落數(shù)目

2、.設(shè)置對(duì)照第四頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件 1、實(shí)例(shl)：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的 要求(yoqi)，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因(yunyn)：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多 數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。.篩選菌株第五頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選(shixun)原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。也就是(jish)用選擇性培養(yǎng)基篩選。第六頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件15.0g瓊脂

3、1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素(nio s)的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)(wl xngzh)看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？固體(gt)培養(yǎng)基從用途看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？從化學(xué)成分看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？選擇培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第七頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離(fnl)與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：在此培養(yǎng)基中哪些(nxi)作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖 氮源：尿素(nio s)第八頁(yè)，共三十五頁(yè)。編

4、輯課件15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解(fnji)尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：此培養(yǎng)基是否對(duì)微生物具有篩選(shixun)作用？如果有，是如何進(jìn)行篩選(shixun)的？有，此培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成(hchng)脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。第九頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件6、怎樣(znyng)證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素(nio s)為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉(n

5、i ru)膏蛋白胨培養(yǎng)基是判斷該培養(yǎng)基有選擇性實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組培養(yǎng)基類(lèi)型是否接種結(jié)果只生長(zhǎng)分解尿素細(xì)菌生長(zhǎng)多種微生物是第十頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件1.稀釋涂布平板法（活菌計(jì)數(shù)法）原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落(jnlu)是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)算方法：每克樣品中的菌落(jnlu)數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。.統(tǒng)計(jì)(tngj)菌落數(shù)目：第十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件 兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)106的培養(yǎng)

6、基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1.第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。 2.第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為結(jié)果。 你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)(zhnsh)值?你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？分析(fnx)：答：都不接近，都需要改進(jìn)。第一位同學(xué)需要設(shè)置(shzh)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組。第二位同學(xué)統(tǒng)計(jì)的三個(gè)菌落數(shù)相差太大，說(shuō)明操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件小結(jié)為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度的稀釋液涂布到三個(gè)或三個(gè)以上(yshng)的平板中培養(yǎng)。為

7、了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出菌落平均數(shù)統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件2、顯微鏡直接(zhji)計(jì)數(shù)法：利用血球計(jì)數(shù)(j sh)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度(nngd)；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件設(shè)置對(duì)照的主要(zhyo)目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。.設(shè)置(shzh)對(duì)照：第十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌 落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)

8、從對(duì)應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50個(gè)菌落。分析(fnx)其原因。原因(yunyn)：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì))如何設(shè)計(jì)(shj)實(shí)驗(yàn)證明呢？第十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置(shzh)是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同(xin tn)土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加(b ji)土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A

9、同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。第十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層(biocng)土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件應(yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤(trng)10g。在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行三樣品(yngpn)的稀釋第十九頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件分離不同(b tn)的微生物采用不同(b tn)的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細(xì)菌104、105、106放線菌103、104、105真菌1

10、02、103、104原因(yunyn)：不同微生物在土壤中含量不同保證獲得(hud)菌落數(shù)在30300之間適于計(jì)數(shù)的平板第二十頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量(shling)，選用的稀釋范圍相同嗎？分析：土壤中各類(lèi)微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。1：為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)(yngdng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第二十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件

11、.取樣(qyng)涂布實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好(zu ho)標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板(pngbn)，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第二十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件.微生物的培養(yǎng)(piyng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)(tngj)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度(wnd)。細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528

12、的溫度下培養(yǎng)34d。第二十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)(j sh)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第二十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件微生物的培養(yǎng)(piyng)與觀察第二十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià) P251.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.稀釋操作是否成功：如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上的菌落數(shù)在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作成功。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重

13、復(fù)(chngf)組的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確，要重新實(shí)驗(yàn)。第二十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件四、操作(cozu)提示 無(wú)菌操作(cozu) 做好標(biāo)記(bioj) 規(guī)劃時(shí)間 第二十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件五.課外(kwi)延伸2、鑒定大腸桿菌的方法：在培養(yǎng)基中添加(tin ji) 培養(yǎng)該細(xì)菌，如果出現(xiàn)菌落呈現(xiàn) ，則說(shuō)明有大腸桿菌。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入 指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高(shn o)，指示劑將變 ，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。酚紅紅1、鑒定分解尿素的細(xì)菌的方法伊紅-美藍(lán)黑色且有金屬光澤第二十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件本課題(kt)知識(shí)小結(jié):第二十九

14、頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)(bioxin)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實(shí)踐(shjin)訓(xùn)練CD第三十頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件3.下列說(shuō)法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試

15、因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他(qt)生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類(lèi)最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類(lèi)藥物 D.高濃度食鹽BC第三十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件5、下列敘述錯(cuò)誤的是 A因?yàn)橥寥乐懈黝?lèi)微生物的數(shù)量不同，所以為獲得不同類(lèi)型的微生物，要按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行分離B測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同C只有得到了3個(gè)或3個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，才說(shuō)明(shumng)稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)D牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌

16、落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些細(xì)菌菌落C 第三十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全(wnqun)滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 合成(hchng)培養(yǎng)基:第三十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。編輯課件 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限;成分(chng fn)復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然(ti