肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷課件

1、結(jié)核分枝桿菌的試驗(yàn)室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科 馬筱玲1結(jié)核分枝桿菌的試驗(yàn)室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科 馬筱玲1結(jié)核疫情及診斷進(jìn)展 2結(jié)核疫情及診斷進(jìn)展 2黛玉臉色蒼白， 瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)束了一場(chǎng)哀怨凄絕的愛(ài)情故事。 3黛玉臉色蒼白， 瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)我國(guó)結(jié)核病疫情 全球結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國(guó)家，結(jié)核病疫情表現(xiàn)有“六多” 。一、感染人數(shù)多億人感染過(guò)結(jié)核菌，約占全國(guó)人口 的，高于全球平均水平。二、患病人數(shù)多活動(dòng)性肺結(jié)核、傳染性肺結(jié)核患病率 分別為萬(wàn)和萬(wàn)，三、新發(fā)患者多全國(guó)每年新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核患者 萬(wàn)， 其中傳染性 肺結(jié)核患者萬(wàn)。 四、死亡人數(shù)多全國(guó)每年約有

2、萬(wàn)人死于結(jié)核病。五、農(nóng)村患者多全國(guó)約有的結(jié)核病人集中在農(nóng)村， 主要在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的中西部地 區(qū)。六、耐藥患者多全國(guó)結(jié)核病耐藥率高達(dá)。 4我國(guó)結(jié)核病疫情 全球結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國(guó)家，結(jié)核病疫情表現(xiàn)有“結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法介紹5結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法介紹5概 述結(jié)核病人的細(xì)菌學(xué)檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是結(jié)核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評(píng)價(jià)治療效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)。由于結(jié)核菌的遺傳特性決定其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，致使常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法存在著靈敏度低、操作復(fù)雜，需時(shí)間較長(zhǎng)和影響因素較多，不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺陷，使細(xì)菌學(xué)診斷發(fā)展緩慢，無(wú)法充分滿足臨床診斷的需要。6概 述結(jié)核病人的細(xì)菌學(xué)檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要

3、途徑和手段實(shí)驗(yàn)室診斷方法病原學(xué)診斷輔助診斷 7實(shí)驗(yàn)室診斷方法病原學(xué)診斷7病原學(xué)診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)三、熒光染色法四、培養(yǎng)法 五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法，七、色譜法 八、分子生物學(xué)法 九、噬菌體生物擴(kuò)增法8病原學(xué)診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，8一、涂片抗酸染色鏡檢法： 國(guó)內(nèi)大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高陽(yáng)性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存較久，可備復(fù)查；因費(fèi)時(shí)、繁瑣，綜合醫(yī)療單位常因重視不夠，致涂陽(yáng)檢出率低于，專業(yè)機(jī)構(gòu)涂陽(yáng)率可達(dá)到。國(guó)外痰涂片陽(yáng)性率可達(dá)，反復(fù)多次查，可增加到；9一、涂片抗酸染色鏡檢法： 國(guó)內(nèi)大多采用厚涂片，比薄涂片法可提涂片優(yōu)點(diǎn)

4、：簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉 10涂片優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉 10 涂片的缺點(diǎn)敏感性低：條菌特異性差：所有分枝桿菌均可著色無(wú)法區(qū)別死菌與活菌：結(jié)果均為陽(yáng)性11 涂片的缺點(diǎn)敏感性低：條菌11痰菌假陰性原因病變是封閉或開(kāi)放；病變性質(zhì)和其中能夠排出的菌量和排出時(shí)間間歇；結(jié)核分枝桿菌形態(tài)多樣性；12痰菌假陰性原因病變是封閉或開(kāi)放；12二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)工作原理 將經(jīng)過(guò)消化滅活處理液處理的痰液、或其他體液標(biāo)本混懸液置于具有符合光學(xué)要求基片的夾層杯中，經(jīng)過(guò)專業(yè)離心機(jī)離心將混懸液中細(xì)菌或細(xì)胞牢固附著基片上，并在夾層杯中直接染色后取出基片在載波片上封片，置顯微鏡下觀察。13二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)工作原理 將

5、經(jīng)過(guò)消化滅優(yōu)點(diǎn)：、操作方便，易于掌握。、片中結(jié)核菌分布均勻，染色效果清晰、液基結(jié)核菌制片技術(shù)較離心濃縮集菌法有顯著提高： 該方法將所有消化后標(biāo)本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標(biāo)本。 采用結(jié)核專用消化液，可有效殺滅結(jié)核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。 14優(yōu)點(diǎn)：14三、熒光染色法：是涂片法中陽(yáng)性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結(jié)合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽(yáng)性率可達(dá)，熒光法的缺點(diǎn)： 假陽(yáng)性率較高， 保存時(shí)間短，不到個(gè)月15三、熒光染色法：是涂片法中陽(yáng)性率較高，較快速的方法，15四、

6、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第第天觀察，以后每周觀察一次菌落生長(zhǎng)情況，第周若仍無(wú)生長(zhǎng)，報(bào)告為陰性。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn).缺點(diǎn)：診斷周期長(zhǎng)，最快也需要周。有一定的污染率16四、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基161717培養(yǎng)假陰性的原因個(gè)別細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求的特異性； 細(xì)菌和細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)代謝異質(zhì)性； 細(xì)菌培養(yǎng)前處理對(duì)細(xì)菌活性影響； 18培養(yǎng)假陰性的原因個(gè)別細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求的特異性； 18 分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)絕對(duì)濃度法檢測(cè)分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)是采用含藥羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行的。常用藥物終濃度（） 表 絕對(duì)濃度法含藥培養(yǎng)基中的藥物終濃度 藥 物 濃

7、度（） 低濃度 高濃度 異煙肼 利福平 鏈霉素 乙胺丁醇 對(duì)氨基水楊酸 氨硫脲 乙硫異煙胺 卡那霉素 卷曲霉素 紫霉素 氧氟沙星 左氧氟沙星 環(huán)丙沙星 司帕沙星 力克肺疾 丁胺卡那 19 分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)絕對(duì)濃度法檢測(cè)分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)是采用檢測(cè)方法 菌懸液的制備 .接種及培養(yǎng).結(jié)果判定與報(bào)告 敏感（一）： 含藥培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)。 報(bào)告菌落數(shù)：當(dāng)含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)在個(gè)以下時(shí)，報(bào)告菌落個(gè)數(shù)。耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥（）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積；耐藥 ()： 含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長(zhǎng)。20檢測(cè)方法 菌懸液的制備

8、20本法弊端 操作繁瑣需時(shí)久，周結(jié)果準(zhǔn)確性差21本法弊端 操作繁瑣21五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)是年建立的一種痰標(biāo)本液體培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡觀察技術(shù)。其原理是含有索狀因子，因此其在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)分泌索狀因子，形成索狀特征性結(jié)構(gòu)，利用倒置顯微鏡觀察索狀結(jié)構(gòu)可用于的快速診斷。由于液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，因此生長(zhǎng)迅速，使的培養(yǎng)時(shí)間顯著縮短，培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著增加。該法還能在培養(yǎng)的同時(shí)直接進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接藥敏試驗(yàn)，因此能顯著縮短從臨床標(biāo)本到耐藥性測(cè)定的所需時(shí)間，這是其它傳統(tǒng)方法所不具有的，也是的最大優(yōu)點(diǎn)。22五、液體培養(yǎng)顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)是年建立的一種痰標(biāo)本液體液體培養(yǎng) 顯微鏡觀察23液體培養(yǎng) 顯微鏡觀察

9、23結(jié) 論本試劑檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，天就可獲得多耐藥結(jié)核桿菌的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結(jié)核病的快速檢測(cè)。痰標(biāo)本直接藥敏試驗(yàn)比常規(guī)方法提早周，更具有快速診斷價(jià)值。本試劑費(fèi)用低廉，不需特殊儀器設(shè)備，適合基層推廣應(yīng)用。本法安全、對(duì)預(yù)防耐藥結(jié)核病的流行與傳播、防止實(shí)驗(yàn)室工作人員的感染具有重要意義。24結(jié) 論24六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法. 培養(yǎng)系統(tǒng). 培養(yǎng)系統(tǒng)25六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法. 培養(yǎng)系統(tǒng)25. 培養(yǎng)系統(tǒng) 基本原理 培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹(shù)脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當(dāng)分支桿菌生長(zhǎng)使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測(cè)儀測(cè)試熒光強(qiáng)度，并判定

10、結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：快速 天培養(yǎng)陽(yáng)性 簡(jiǎn)便 比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便， 培養(yǎng)陽(yáng)性率高于法 缺點(diǎn)：無(wú)法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于法，產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴26. 培養(yǎng)系統(tǒng)26 培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長(zhǎng)情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應(yīng)器，當(dāng)培養(yǎng)瓶中有細(xì)菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生、下降時(shí)，顏色感應(yīng)器由綠色變成黃色。儀器自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)，檢測(cè)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果自動(dòng)顯示培養(yǎng)瓶中有無(wú)分支桿菌生長(zhǎng)。優(yōu)點(diǎn)：快速 天培養(yǎng)陽(yáng)性 簡(jiǎn)便 比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便， 培養(yǎng)陽(yáng)性率高于法 缺點(diǎn)：無(wú)法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于法， 產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴。27 培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)中分

11、支七、色譜法 分為氣相色譜()、氣液相色譜、高效液相色譜()等等能檢測(cè)分枝桿菌代謝過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸所產(chǎn)生的含量，出現(xiàn)不同的色譜峰，從而可鑒定結(jié)核桿菌和大部分菌種，且可測(cè)藥敏。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、定量、重復(fù)性好，與質(zhì)譜()聯(lián)用更好；缺點(diǎn)：儀器昂貴，維護(hù)不易，無(wú)法普及。 28七、色譜法 分為氣相色譜()、氣液相色譜、高效液相色譜()等八、分子生物學(xué)法 利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)結(jié)核桿菌特異性基因片斷，從而為結(jié)核病的快速診斷提供依據(jù)。、聚合酶鏈反應(yīng)()：、核酸探針()、染色體核酸指紋法：、()序列法、耐藥基因的檢則：、其它分子生物學(xué)方法29八、分子生物學(xué)法 利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法來(lái)檢、聚合

12、酶鏈反應(yīng)()：能快速擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題是影響其應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。對(duì)于存在的問(wèn)題對(duì)策如下：擴(kuò)增產(chǎn)物特異性鑒定探針雜交高質(zhì)量試劑（建立國(guó)家級(jí)檢定考評(píng)）規(guī)范化操作（培訓(xùn)操作人員）質(zhì)量控制 （標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室）30、聚合酶鏈反應(yīng)()：能快速擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌，30、核酸探針()探針是一小段帶標(biāo)記而能識(shí)別特異性核苷酸序列的單鏈分子。、染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內(nèi)切酶圖譜()和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性()分析等，用于菌株菌種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查研究。31、核酸探針()探針是一小段帶標(biāo)記而能識(shí)別特異性核苷酸序列的單、()序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來(lái)。

13、、耐藥基因的檢則：已查出的結(jié)核桿菌耐藥基因有(對(duì)利福平)，、(對(duì)異煙肼)，(對(duì)乙胺丁醇)，、(對(duì)鏈霉素)，(對(duì)吡嗪酰胺)和(對(duì)氟喹諾酮類，則為低度耐藥)等。32、()序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌 九、噬菌體生物擴(kuò)增法（） 該法建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定。近年來(lái)進(jìn)展很快。33 九、噬菌體生物擴(kuò)增法（） 該法建立，并用于結(jié)核33 檢測(cè)原理 分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細(xì)胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細(xì)胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)噬菌斑。 若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時(shí)間后在加噬菌體檢測(cè)，并以不

14、加藥管為對(duì)照，根據(jù)含藥管和不含藥管出現(xiàn)的噬菌斑情況即可判斷細(xì)菌的耐藥性。34 檢測(cè)原理 分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌噬菌體 病毒核酸衣殼只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)溶原性感染和溶菌性感染35噬菌體 病毒核酸衣殼只能在活的易感細(xì)胞 特異性噬菌體識(shí)別,并與之結(jié)合36 特異性噬菌體識(shí)別,并與之結(jié)合36噬菌體進(jìn)入細(xì)胞,并在其內(nèi)擴(kuò)增;同時(shí)生產(chǎn)蛋白外殼,開(kāi)始產(chǎn)生新的病毒顆粒37噬菌體進(jìn)入細(xì)胞,并在其內(nèi)擴(kuò)增;同時(shí)生產(chǎn)蛋白外殼,開(kāi)始產(chǎn)生新的添加特異性殺病毒劑去除所有胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。38添加特異性殺病毒劑去除所有胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。終止殺病毒反應(yīng)，添加非致病性，快生長(zhǎng)分枝桿菌（敏

15、感細(xì)胞）39終止殺病毒反應(yīng)，添加非致病性，快生長(zhǎng)分枝桿菌（敏感細(xì)胞）39結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40細(xì)胞周?chē)拿舾屑?xì)胞，并在其胞內(nèi)增殖41細(xì)胞周?chē)拿舾屑?xì)胞，并在其胞內(nèi)增殖41經(jīng)過(guò)多個(gè)“感染增殖細(xì)胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見(jiàn)，清晰的噬菌斑42經(jīng)過(guò)多個(gè)“感染增殖細(xì)胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上4343結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染的噬菌體敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞裂解, 釋放出來(lái)的噬菌體感染敏感細(xì)胞噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生噬菌斑 先以特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染的噬菌體，而結(jié)核分枝

16、桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴(kuò)增，進(jìn)而裂解細(xì)胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細(xì)胞，在其胞內(nèi)擴(kuò)增并裂解敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上肉眼可見(jiàn)的噬菌斑。如待檢標(biāo)本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無(wú)噬菌體感染敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上無(wú)噬菌斑出現(xiàn)。44結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染的噬菌體敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞敏感細(xì)質(zhì)控 陽(yáng)性對(duì)照 個(gè)噬菌斑 陰性對(duì)照 個(gè)噬菌斑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本 陽(yáng)性結(jié)果 個(gè)噬菌斑 陰性結(jié)果 個(gè)噬菌斑陰性：無(wú)噬菌斑陽(yáng)性：可數(shù)噬菌斑陽(yáng)性：噬菌斑部分融合陽(yáng)性：噬菌斑完全融合45質(zhì)控結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本陰性：陽(yáng)性：陽(yáng)性：陽(yáng)性：45適用范圍可檢測(cè)痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標(biāo)

17、本用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷抗癆治療效果的評(píng)價(jià)尤其是初診病人的鑒別診斷用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測(cè)用于高危人群的鑒別診斷 From England !46適用范圍可檢測(cè)痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標(biāo)本F藥敏試驗(yàn)47藥敏試驗(yàn)47 M. tb bacillus Sensor cellSensor cellSensor cellSensor cellSensor cell指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞l 室溫分鐘 小時(shí)小時(shí)加入殺毒劑加入培養(yǎng)基和指示細(xì)胞藥物細(xì)菌小時(shí)加入噬菌體48 敏感株結(jié)果 無(wú) 含49 敏感株結(jié)果 無(wú) 耐藥株結(jié)果 無(wú) 含 50耐藥株結(jié)果 無(wú) 含 50上 海 市 結(jié) 核

18、（肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)快速：小時(shí)比較靈敏：條檢測(cè)活菌：相對(duì)定量：安全：51上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 方法評(píng)價(jià)缺點(diǎn)操作步驟多影響因素多有假陽(yáng)性和假陰性 假陰性率假陽(yáng)性率52上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室假陽(yáng)性和假陰性原因噬菌體的交叉感染 種檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性 （偶然、胞內(nèi)、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對(duì)結(jié)果的影響 53上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 輔助診斷一、免疫學(xué)診斷方法二、血清學(xué)診斷三、酶學(xué)診斷54輔助診斷一、免疫學(xué)診斷方法54一、免疫學(xué)診斷方法皮試，用于鑒別診斷有參考意義。細(xì)胞亞群和一些細(xì)胞因子：、()、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細(xì)胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標(biāo)前后對(duì)比。55一、免疫學(xué)診斷方法皮試，用于鑒別診斷有參考意義。55二.血清學(xué)診