強(qiáng)化胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響

1、強(qiáng)化胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響強(qiáng)化胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響【關(guān)鍵詞】2型糖尿病;大鼠;強(qiáng)化胰島素治療;胰島;凋亡【摘要】目的觀察強(qiáng)化胰島素治療對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響。方法將36只istar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和高脂組，正常對(duì)照組給予根底飼料喂養(yǎng)，高脂組給予脂肪乳灌胃+根底飼料喂養(yǎng)10d，然后給高脂組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素，3d后再將高脂組大鼠隨機(jī)分為2個(gè)亞組，即糖尿病對(duì)照組和糖尿病胰島素治療組，治療4。脂肪乳灌胃第10天、注射stz第3天和治療4末測(cè)大鼠各項(xiàng)指標(biāo);實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)采用tunel技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰島細(xì)胞的凋亡。結(jié)果大鼠在強(qiáng)化胰島素

2、治療4末，分別采用tunel和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡，與糖尿病對(duì)照組比較，糖尿病胰島素治療組胰島細(xì)胞凋亡率明顯下降，分別為(0.730.02)%vs(0.190.04)%和(13.500.12)%vs(3.560.71)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論強(qiáng)化胰島素治療可減輕2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】2型糖尿病;大鼠;強(qiáng)化胰島素治療;胰島;凋亡胰島細(xì)胞功能缺陷作為2型糖尿病(t2d)發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，近年來(lái)受到越來(lái)越多的重視，有觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能受損，比胰島素抵抗(ir)在t2d的發(fā)病過(guò)程中起著更為重要的作用1，2。本研究旨在觀察強(qiáng)化胰島素治療對(duì)t2d大鼠胰島細(xì)胞

3、凋亡的影響。1材料與方法1.1動(dòng)物模型的建立和分組清潔級(jí)遠(yuǎn)交群雄性istar大鼠36只，體重180220g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n組，n=12)和高脂組(hf組，n=24)，正常對(duì)照組給予根底飼料喂養(yǎng)(能量比：碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白質(zhì)24.2%);高脂組給予脂肪乳灌胃(能量比：碳水化合物43%，脂肪41%，蛋白質(zhì)16%)+根底飼料喂養(yǎng)10d。在ir形成后，給高脂組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(stz)，注射劑量30g/kg，注射3d時(shí)假設(shè)空腹血糖(fpg)7.8l/l及胰島素敏感指數(shù)(isi)降低，提示t2d大鼠造模成功3。將造模成

4、功大鼠再隨機(jī)分為2個(gè)亞組，即d對(duì)照組(d，n=12)，腹部皮下注射生理鹽水;胰島素治療組(di，n=12)，每日1718時(shí)在腹部皮下注射諾和靈n23u/d。根據(jù)上午8時(shí)血糖結(jié)果，每3d調(diào)整胰島素用量，使血糖維持在n組的程度，治療共4。1.2試劑與方法分別在脂肪乳灌胃第10天、注射stz第3天和治療4末測(cè)定大鼠體重(b)、fpg、空腹血清胰島素(fins)、肽(p)，在1%戊巴比妥鈉麻醉下(30g/kg)，從心臟取血獲得標(biāo)本。血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，fins、p采用放免法測(cè)定，游離脂肪酸(ffa)采用試劑盒測(cè)定。治療4末，給大鼠用戊巴比妥鈉(30g/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，

5、翻開(kāi)腹腔，立即別離并取出胰腺，一部分置于10%多聚甲醛中固定，另留取少量標(biāo)本切成約1113大小的組織塊，置于70%酒精內(nèi)。分別采用dutp缺口標(biāo)記技術(shù)(tunel)和流式細(xì)胞術(shù)(f)檢測(cè)胰島細(xì)胞的凋亡。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用spss12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展處理，數(shù)據(jù)以xs表示，測(cè)定結(jié)果進(jìn)展正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，偏態(tài)分布變量胰島素取自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)為正態(tài)分布后進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。2結(jié)果2.1大鼠脂肪乳灌胃第10天的b、fpg、fin、p及ffa含量變化hf組的b、fins、p和ffa較n組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05，p0.01);fpg與n組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義(p0.05)。見(jiàn)表1。2.2大鼠注射stz第3天的b、fpg、fin、p及ffa含量變化hf組的b、fpg和ffa較n升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);fin、p與n組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。見(jiàn)表2。2.3大鼠治療4末的b、fpg、fin、p及ffa含量變化d組和di組大鼠各死亡1只。fin、p在n組、d組和di組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與d組比較，di組的b升高，fpg、ffa降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01，p0.05)。與n組比較，d組的b降低，fpg、ffa升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05，p0.01)。見(jiàn)表3。2.4胰島細(xì)胞凋亡結(jié)果凋亡細(xì)

7、胞的核呈棕褐色著染，d組有大量tunel陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布，為(0.730.02)%，明顯高于n組(0.170.05)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與d組比較，di組偶見(jiàn)tunel陽(yáng)性細(xì)胞，為(0.190.04)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。見(jiàn)圖1。d組大鼠胰島細(xì)胞凋亡率升高，為(13.500.12)%，明顯高于n組(2.770.53)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與d組比較，di組胰島細(xì)胞凋亡率明顯下降至(3.560.71)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。見(jiàn)圖2。表1兩組大鼠脂肪乳灌胃第10天的各項(xiàng)指標(biāo)表2兩組大鼠注射stz第3天的各項(xiàng)指標(biāo)表3兩組大鼠治療4末的各項(xiàng)指標(biāo)

8、圖1治療4末tunel技術(shù)檢測(cè)的各組凋亡胰島細(xì)胞(400)圖2治療4末f檢測(cè)的各組凋亡胰島細(xì)胞3討論研究證實(shí)，無(wú)t2d的肥胖者通過(guò)增加胰島細(xì)胞的數(shù)量來(lái)適應(yīng)ir，而肥胖的t2d患者那么有60%的胰島細(xì)胞數(shù)量缺失。無(wú)論是肥胖還是非肥胖的t2d患者，與其體重指數(shù)相當(dāng)?shù)姆莟2d人群相比，胰島細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胰島細(xì)胞凋亡發(fā)生率也明顯高于正常人群，在肥胖和消瘦的t2d患者中胰島細(xì)胞的凋亡頻率分別增加了3倍和10倍4。上述結(jié)果提示胰島細(xì)胞凋亡使其數(shù)量減少在t2d患者胰島細(xì)胞功能衰竭中發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有多種：形態(tài)學(xué)觀察;流式細(xì)胞術(shù);原位末端標(biāo)記技術(shù)，包括tunel和inst技術(shù);瓊脂糖凝膠

9、電泳;凋亡相關(guān)蛋白分析;凋亡酶學(xué)分析等。在進(jìn)展凋亡有關(guān)的研究時(shí)，需要23種以上的方法結(jié)合應(yīng)用5。tunel技術(shù)是1992年由gavrieli等6首次提出的一種可進(jìn)展原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞的分子生物學(xué)免疫組織化學(xué)方法，它比瓊脂糖凝膠電泳法更加直觀、準(zhǔn)確和快速7。f是目前用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞最靈敏的方法之一，可以到達(dá)同時(shí)定性定量的要求。li等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠予以胰島素治療后，細(xì)胞的胰島素分泌功能及細(xì)胞的凋亡明顯改善8。本研究顯示在強(qiáng)化胰島素治療4后，與n組低胰島細(xì)胞凋亡率比較，d組胰島細(xì)胞凋亡率明顯增加;與d組比較，di組胰島細(xì)胞凋亡率均明顯減少。提示強(qiáng)化胰島素治療能有效保護(hù)胰島細(xì)胞凋亡，起到延緩t2d發(fā)生的作用。在t2d，高血糖、高脂血癥等都是誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的主要因素。研究說(shuō)明，血脂紊亂、血清ffa升高，既引起細(xì)胞胰島素分泌功能缺陷，又導(dǎo)致ir的發(fā)生和胰島細(xì)胞凋亡增加。本研究顯示大鼠注射stz第3天，與n組比較，d組血清ffa出現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明t2d大鼠出現(xiàn)了高ffa血癥;di組血清ffa顯著低于d組，提示強(qiáng)化胰島素治療可以改善與胰島細(xì)胞功能關(guān)系親密的高ffa血癥，改善t2d大鼠的血脂紊亂。另有研究說(shuō)明脂質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性作用隨葡萄糖濃度的增加而增加，降低血糖程度脂毒性也隨之減弱9，10，即高脂對(duì)組織的