實(shí)驗(yàn)三 植物組織RNA的提取與分析課件

1、1實(shí)驗(yàn)三 植物組織RNA的提取與鑒定2（1）通過本實(shí)驗(yàn)，了解RNA的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)。（2）學(xué)會使用Trizol法提取植物總RNA。（3）學(xué)習(xí)和掌握總RNA的檢測實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)原理。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理 RNA的提取是進(jìn)行分子克隆和基因表達(dá)分析等研究的基礎(chǔ)。但RNA很容易被內(nèi)源及外源的RNase降解，所以要得到未被降解的、不含DNA與其它雜質(zhì)的RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提。 目前較為成熟的分離RNA的方法有許多，用于植物細(xì)胞總RNA的提取主要有苯酚法、異硫氰酸胍法、氯化鋰沉淀法、SDS/酚抽提法，或應(yīng)用商品化的Trizol試劑和Qiagen等各類試劑盒進(jìn)行提取。但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁

2、，內(nèi)含較多的多糖、脂質(zhì)、多酚等次生代謝物，同種植物的不同組織和不同植物的同種組織材料，其RNA的提取方法也會有很大差異。適宜的RNA提取材料處理方法也不盡相同。二、實(shí)驗(yàn)原理 Trizol試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA。 用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少，可以用來做Northern，RT-PCR，分離mRNA，體外翻譯和分子克隆等。 5三、儀器和試劑1、儀器： 高速冷凍離心機(jī)、微波爐、穩(wěn)壓電源、水平電泳

3、槽、凝膠成像系統(tǒng)。2、材料與試劑： 液氮、Trizol、氯仿、異丙醇、70%乙醇、DEPC處理的蒸餾水、瓊脂糖、1TAE、上樣緩沖液。7四、實(shí)驗(yàn)步驟1、RNA的提?。?）4，12000r/min離心10min。（6）吸取上清液置于一個新的1.5mL的無RNA酶的離心管中，加入600uL異丙醇，-20放置30min。（7）4，12000r/min離心10min。棄去上清液。（8）向離心管中加入1mL70%乙醇，漂洗沉淀物。4，5000r/min離心3min。棄去上清液。（此步可省略）（9）待沉淀物自然干燥后，加入20uLDEPC處理的蒸餾水，充分溶解后，即為RNA溶液。8四、實(shí)驗(yàn)步驟2、RNA電泳檢測（1）1%瓊脂糖凝膠：稱取0.2g瓊脂糖，加入20mL 1TAE緩沖液，加入20uL甲醛溶液（可省略），在微波爐中加熱，反復(fù)加熱、振蕩2-3次，使瓊脂糖充分融化。待凝膠冷卻至60左右，倒入插入梳子的凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。（2）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右搖晃，以免破壞膠面及加樣孔，小心將