血管生成及其成熟度在肝細(xì)胞癌邊緣與中心的差異研究

1、血管生成及其成熟度在肝細(xì)胞癌邊緣與中心的差異研究【摘要】目的：討論肝細(xì)胞癌(hepatellulararina,H)邊緣和中心血管生成及其成熟度的差異。方法：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)病灶邊緣(A組)和中心區(qū)域組織(B組)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vasularendthelialgrthfatr,VEGF)、Flk-1、增殖細(xì)胞核抗原(prliferatingellnulearantigen，PNA)的表達(dá)情況，并對(duì)微血管和成熟血管的數(shù)目、平均面積、總面積、周長(zhǎng)、直徑、異型指數(shù)、血管間距、表達(dá)部位，以及動(dòng)脈數(shù)、靜脈數(shù)、動(dòng)脈比、靜脈比、血管成熟指數(shù)和平均灌注分?jǐn)?shù)等進(jìn)展計(jì)數(shù)。分析以上血管生成相關(guān)參數(shù)在腫瘤

2、邊緣和中心的差異。結(jié)果：兩組微血管的數(shù)目、直徑及異型指數(shù)，成熟血管的數(shù)目、總面積、動(dòng)脈數(shù)、動(dòng)脈比及靜脈比，血管成熟指數(shù)及平均灌注分?jǐn)?shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。A組微血管和成熟血管的數(shù)目、平均面積、總面積、直徑、異型指數(shù)及血管間距差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而B組微血管和成熟血管的數(shù)目、總面積、異型指數(shù)及血管間距差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，但平均面積、周長(zhǎng)和直徑比擬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：H邊緣和中心的微血管和成熟血管的多個(gè)形態(tài)學(xué)特征存在差異，病灶中心血管多為幼稚的微血管，邊緣那么以成熟血管居多。【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌血管生成，病理性【ABSTRAT】bjetiv

3、e:Tstudythedifferenesinangigenesisanditsaturatinbeteentheperipheryandenter.fhepatellulararina(H).ethds：Thirty-neasesprvedsurgiallyandpathlgiallyereseleted.Aftersurgery,tsetinseregttenfrtheturperipheryandenter.ntinuusslieserestainedithiunhistheistryffiveantibdiesagainstVEGF,Flk-1,PNA.TheexpressinsfVE

4、GF，F(xiàn)lk-1,andPNA,andsevasularparaetersereuntedinludingthenuber,eanarea,ttalarea,iruferene,diaeter,distanebeteenadjaentvessels(DAV),varietyindexfirvesselandaturevessels.Thearteriles,vEinlets,aturevesselindexandeanperfusedfratin(PF)erealsalulated.Thedifferenesfthevasularparaetersabvebeteentheperipherya

5、ndenterereanalyzed.Results:Thedifferenesinthenuber,diaeter,andvarietyindexfirvessel,thenuberandttalareafaturevessel,thearterilesandtheratifarterilervEInlet,aturevesselindexandPFerestatistialdifferenesbeteentheperipheryandenterfthetur(P0.05).Inturperiphery,ealsfundstatistialthedifferenesinthenuber,ea

6、narea,ttalarea,diaeter,varietyindexandDAVbeteenirvsselandaturevessel(P0.05),andserethedifferenesinthenuber,ttalarea,varietyindexandDAVbeteenirvsselandaturevesselintheturenter(P0.05).nlusin:Therearedifferenesinsevasularharateristisfirvesselandaturevessel,andtheinfantvesselsftenurintheturenter,hilethe

7、aturevesselinperiphery.【KEYRDS】HepatellulararinaNevasularizatin,pathlgi腫瘤的發(fā)生、開展及轉(zhuǎn)移與血管生成親密相關(guān)1-3，理解腫瘤的血管生成情況有助于進(jìn)步對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)，并可以指導(dǎo)治療、改善療效4。目前利用病理學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤組織進(jìn)展血管計(jì)數(shù)是評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)。但是近年的研究發(fā)現(xiàn)5-7，腫瘤血管不僅僅數(shù)目增多，同時(shí)也存在直徑、周長(zhǎng)、面積、分布及血管成熟度等多個(gè)方面的變化，僅僅依靠血管計(jì)數(shù)并不能完全反映腫瘤的血管生成特征。因此Flkan等8后來提出單純用微血管密度來評(píng)估腫瘤新生血管并不準(zhǔn)確。只有從各個(gè)方面評(píng)價(jià)腫瘤的

8、血管生成特點(diǎn)，才能對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為和治療效果做出準(zhǔn)確評(píng)估。本研究對(duì)多個(gè)血管生成相關(guān)抗體進(jìn)展染色，討論肝細(xì)胞癌(hepatellulararina，H)邊緣和中心血管生成及其成熟度的差異，旨在全面和深化理解H的血管生成特點(diǎn)。1資料與方法1.1一般資料搜集2022年111月在我院普外科進(jìn)展手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的H病例31例，其中男20例，女11例，年齡3672歲，平均年齡54.80歲。在病灶邊緣和中心區(qū)域所取的標(biāo)本分別為A組和B組。所有病例手術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療，臨床資料完好。1.2實(shí)驗(yàn)方法在切下的病灶最大徑處縱行將其剖開，觀察并記錄病灶的大體病理表現(xiàn)后常規(guī)固定，在病灶邊緣和中心區(qū)域各

9、取1塊大小約為23的標(biāo)本，邊緣區(qū)域組織同時(shí)還應(yīng)包括周圍約0.51的正常肝組織，中心區(qū)取材盡可能避開壞死和出血的組織。31個(gè)病灶共取標(biāo)本62塊，每塊標(biāo)本厚5。常規(guī)石蠟包埋后行4連續(xù)切片，從中隨機(jī)各取出1張進(jìn)展HE染色，其他的均行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)展。1.3主要試劑及儀器VEGF、Flk-1、-SA、D34和PNA單克隆抗體、PV9000二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)產(chǎn)品;捷達(dá)(JD801)形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)由捷達(dá)科技消費(fèi)。1.4結(jié)果斷定1.4.1VEGF、Flk-1及PNA結(jié)果判斷VEGF、Flk-1陽(yáng)性染色是在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。在

10、400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)展評(píng)分：無陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞率30%為1分，30%70%為2分，70%為3分;按染色強(qiáng)度將其分為4個(gè)等級(jí)：無著色者0分，陽(yáng)性細(xì)胞為淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。將兩個(gè)分值相乘，得分03者為陰性，4分者為陽(yáng)性表達(dá)。PNA主要在細(xì)胞核中表達(dá)，PNA指數(shù)(PNAindex,PI)=PNA染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)100%。1.4.2D34和-SA結(jié)果判斷D34和-SA陽(yáng)性染色分別為內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)和血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒，D34染色陽(yáng)性血管為微血管，-SA陽(yáng)性血管為成熟血管。利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)無蘇木精復(fù)染的陽(yáng)性血管進(jìn)展自動(dòng)分析，

11、根據(jù)eidner方法9在400倍鏡下記錄5個(gè)視野中的血管評(píng)價(jià)參數(shù)并取其平均數(shù)。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：血管數(shù)目、平均面積、總面積、周長(zhǎng)、直徑、血管間距和異型指數(shù)。異型指數(shù)=根據(jù)成熟血管的最小外徑比(-SA陽(yáng)性厚度/成熟血管最小外徑)來區(qū)分動(dòng)脈和靜脈，凡最小外徑比1/10為動(dòng)脈，否那么為靜脈10。計(jì)算動(dòng)脈數(shù)、靜脈數(shù)、動(dòng)脈比(動(dòng)脈數(shù)/成熟血管數(shù))、靜脈比(靜脈數(shù)/成熟血管數(shù))以及血管成熟指數(shù)(成熟血管數(shù)/微血管密度)和平均灌注分?jǐn)?shù)(成熟血管總面積/D34陽(yáng)性血管總面積)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件包進(jìn)展數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果本組病例共31個(gè)病灶，大體

12、病理顯示病灶直徑3.011.0，平均直徑為(5.642.24)，直徑5的病灶占58.06%(18/31)。同時(shí)合并肝硬化的病灶54.84%(17/31)。病理分級(jí)高、中和低分化的腫瘤分別占12.9%(4/31)、41.94%(13/31)和45.16%(14/31)。2.1兩組H各血管參數(shù)的差異對(duì)于微血管而言，兩組的微血管數(shù)目、直徑及異型指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表1，圖1);對(duì)于成熟血管，兩組的成熟血管數(shù)目、總面積、動(dòng)脈數(shù)、動(dòng)脈比及靜脈比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表2，見圖1)。另外，A、B兩組動(dòng)脈比分別為0.750.13和0.590.15，靜脈比那么為0.250.11和0.

13、410.18，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同樣，兩組的血管成熟指數(shù)及平均灌注分?jǐn)?shù)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表3)。其他參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2微血管和成熟血管相對(duì)應(yīng)測(cè)量參數(shù)的比擬在A組微血管和成熟血管的數(shù)目、平均面積、總面積、直徑、異型指數(shù)及血管間距差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);B組微血管和成熟血管的數(shù)目、總面積、異型指數(shù)及血管間距差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，但平均面積、周長(zhǎng)和直徑之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表4)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論惡性腫瘤的快速生長(zhǎng)需要更多的血氧供給，腫瘤血管的大量增生使腫瘤的血流灌注面積和灌注量明顯增加。VEGF

14、是目前的誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高的調(diào)控因子，它主要通過受體Flk-1、Flt-1等發(fā)揮刺激血管生長(zhǎng)、進(jìn)步血管通透性的作用。近年的研究證實(shí)腫瘤新生血管分為不成熟的無血流灌注的內(nèi)皮細(xì)胞芽、無周圍細(xì)胞環(huán)繞的小灌注血管和有周圍細(xì)胞環(huán)繞的較大的成熟血管4。盡管腫瘤新生血管數(shù)目增多，但腫瘤的血液供給主要依靠成熟的血管11。研究報(bào)道，黑色素瘤和淋巴瘤的微血管數(shù)目并不豐富，但其生長(zhǎng)速度和惡性程度并不低于微血管數(shù)目相對(duì)較多的腫瘤，如高分化的膠質(zhì)瘤等12-13，提示腫瘤內(nèi)成熟血管對(duì)于腫瘤的血供發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)有功能的毛細(xì)血管占瘤內(nèi)血管的比例5%，而腫瘤內(nèi)部大量的非成熟血管極少參與腫瘤的營(yíng)

15、養(yǎng)供給9。同時(shí)，非成熟血管缺乏平滑肌細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞易于脫落轉(zhuǎn)移14。因此區(qū)分功能性和非功能性血管(即判斷血管成熟度)可以對(duì)腫瘤的預(yù)后進(jìn)展一定程度的評(píng)估。目前抗血管生長(zhǎng)治療主要針對(duì)非成熟度的血管，理解腫瘤內(nèi)部成熟和非成熟血管的分布、數(shù)量及其他形態(tài)特點(diǎn)有利于針對(duì)性地進(jìn)展干預(yù)，從而進(jìn)步抗腫瘤血管生成治療的效果。目前判斷血管成熟的方法多是利用-SA對(duì)血管平滑肌進(jìn)展標(biāo)記15。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于微血管而言，病灶邊緣的微血管數(shù)目和異型指數(shù)明顯小于中心，而微血管直徑那么相反。與正常的毛細(xì)血管不同，腫瘤血管粗細(xì)不均、分支紊亂、管腔不規(guī)那么，因此其血液黏滯度和血流阻力也相應(yīng)增加;同時(shí)因?yàn)閺V泛存在動(dòng)靜脈瘺，腫瘤內(nèi)部壓

16、力因血管通透性增加以及缺乏淋巴管引流而增加(為正常間質(zhì)組織的35倍)16，所以腫瘤中心常常出現(xiàn)缺氧并容易壞死。受到乏氧誘導(dǎo)因子的影響，腫瘤內(nèi)部VEGF及Flk-1的表達(dá)明顯增高，微血管的數(shù)目也相應(yīng)增加。本研究未發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣和中心之間VEGF表達(dá)的差異，由于血管生成是受多個(gè)血管因子的共同調(diào)控，因此本組病例中VEGF的作用并不突出。但研究顯示病灶中心的微血管數(shù)目明顯大于邊緣，同時(shí)，病灶中心微血管的異型指數(shù)大于邊緣，這提示腫瘤內(nèi)部新生血管在乏氧的誘導(dǎo)下大量增殖，但多為較幼稚的、不成熟的血管，形態(tài)變化較大。另外，病灶中心微血管直徑小于邊緣也提示這些血管的幼稚性。病灶邊緣的成熟血管數(shù)目、總面積、動(dòng)脈數(shù)、

17、動(dòng)脈比明顯大于中心組織，但靜脈比那么相反;同時(shí)，本研究還說明病灶邊緣的血管成熟指數(shù)及平均灌注分?jǐn)?shù)明顯大于病灶中心。由于成熟血管數(shù)目對(duì)腫瘤血供起主要作用，也說明了腫瘤邊緣的血液供給明顯優(yōu)于病灶中心。D34染色陽(yáng)性血管代表微血管，而-SA那么反映成熟血管，本研究將H邊緣及中心的微血管和成熟血管相對(duì)應(yīng)的測(cè)量參數(shù)進(jìn)展了比擬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除周長(zhǎng)之外，病灶邊緣的微血管和成熟血管的數(shù)目、平均面積、總面積、直徑、異型指數(shù)及血管間距差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在病灶中心，微血管和成熟血管的數(shù)目、總面積、異型指數(shù)及血管間距差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但平均面積、周長(zhǎng)和直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成熟血管的異型指數(shù)明顯小于微血管，也提

18、示成熟血管更加規(guī)那么和完好。微血管和成熟血管測(cè)量參數(shù)在腫瘤邊緣和中心的差異，也說明血管生成受復(fù)雜因素的影響而產(chǎn)生較大的異質(zhì)性?？傊?，H邊緣和中心的微血管和成熟血管的多個(gè)形態(tài)學(xué)特征存在較大的差異，相對(duì)而言，病灶中心多以幼稚的微血管為主，而邊緣那么以成熟血管居多。受此影響，病灶邊緣血供豐富;而中心那么相對(duì)較差，更易出現(xiàn)壞死。根據(jù)H邊緣和中心區(qū)域血管類型的差異，針對(duì)性地進(jìn)展治療，有助于進(jìn)步抗腫瘤血管生成生物治療的效果?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1FlkanJ,ShingY.Angigenesis(Revie)J.JBilhe,1992,267(16):10931-10934.2EidnerN,SepleJP,el

19、hR,etal.Turangigenesisandetastasis-rrelatinininvasivebreastarinaJ.NEnglJed,1991,324(1):1-8.3周天保,楊廣順.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-9在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義J.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2022,9(5):278-280.4GeeS,PrpiN,aknenS,etal.Turvesseldevelpentandaturatinipseliitsntheeffetivenessfanti-vasulartherapyJ.AJPathl,2022，162(1):183-189.5kK,K

20、aaR.irvasularnetrkinrenalarinas.QuantitativeandtissueirarrayiunhistheialstudyJ.PlJPathl,2022,59(2):107-115.6FrsbergF,KuruvillaB,PasuaB,etal.paringntrast-enhanedlrfliagingandpathlgialeasuresfbreastlesinvasularityJ.UltrasundedBil,2022,34(9):1365-1372.7SharaS,Shara,GuptaDK,etal.AngigenipatternsandthEIr

21、quantitatininhighgradeastrytitursJ.JNeurnl,2022,79(1):19-30.8HlatkyL,HahnfeldtP,FlkanJ.linialappliatinfantiangigenitherapy:irvesseldensity,hatitdesanddesnttellusJ.JNatlanerInst,2002,94(12):883-893.9eidnerN,FlkanJ,PzzaF,etal.Turangigernsis:anesignifiantandindependentprgnstiindiatrinearlystagebreastarinaJ.JNatlanerInst,1992，84(24):1875-1887.10劉燕,閩鵬秋,陳衛(wèi)霞,等.肝細(xì)胞癌血管生成的螺旋T動(dòng)脈期同層動(dòng)態(tài)掃描與-平滑肌素免疫組織化學(xué)的相關(guān)性J.中華放射學(xué)雜志,2022,39(6):646-651.11GileadA,eirG,Neean.Therlefangigenesis,vasularaturatin,regressinandstrainfiltratinindranyandgrthfiplantedLSvarianarinaspheridsJ.IntJaner,2022,108(4):524-531.12