熒光PCR定量質(zhì)量控制及防污染綜合措施

1、熒光PCR定量質(zhì)量控制及防污染措施解放軍第三0二醫(yī)院王海濱寫在課前的話近幾年在臨床檢測病毒核酸和細(xì)菌核酸上，熒光定量PCR技術(shù)越來越廣泛。但是如何進(jìn)行治療控制以及浮現(xiàn)污染 后如何進(jìn)行清除污染？本文重要講述如何來避免污染的產(chǎn)生。一、熒光PCR定量的概述（一）熒光PCR定量的原理實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán)，運(yùn)用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程， 最后通過原則曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的措施。常規(guī)的PCR也就是電泳PCR，它是合成一種正向引物和反向引物為 目的模板，即DNA或RNA作為一種模板擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過跑電泳的方式來檢測它存在與否，是相對量的變化。由于跑電 泳

2、常常導(dǎo)致產(chǎn)物外泄，因此污染的幾率比較高。近幾年P(guān)CR擴(kuò)增時在參入一對引物的同步參入單個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記單 個報(bào)告熒光基團(tuán)和單個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸??；PCR擴(kuò)增時，Taq酶 的5端3端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接受到熒光信號， 即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有單個熒光分子構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物構(gòu)成完全同步。通過熒光物質(zhì)參入和TapMan探針技術(shù)來做實(shí)時熒光PCR,避免了電泳檢測成果的過程，使整個PCR過程從擴(kuò)增到檢 測都在一種封閉的狀態(tài)。熒光集團(tuán)目前臨床常用的

3、有兩個，一種是SYBR green，一種是TapMan探針。SYBR green是一 類熒光染料，能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，因此特異性不如TaqMan探針。變性后雙螺旋 變成單鏈，然后作為擴(kuò)增的模板。在擴(kuò)增的過程中由變性到負(fù)性擴(kuò)出了另一條鏈和模板DNA進(jìn)行退火變成雙鏈。這時SYBR green染料與DNA雙鏈結(jié)合,發(fā)出熒光信號。用SYBR green熒光染料來作為批示劑時，中間要加一種溶解曲線來證明它 的特異性的問題。另一種是TapMan探針，在兩個引物中間設(shè)立一條特異性的探針，它標(biāo)記有熒光染料通過激發(fā)和檢測的過程來檢 測特異性擴(kuò)增模板的存在。（二）PCR原理圖典型的

4、pcr三街環(huán)mog。個模仿機(jī)體核酸合成的條什知過 程，典型的pcr三街環(huán)mog。個模仿機(jī)體核酸合成的條什知過 程，在通過體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)已 知核酸的族大神瞼測*第二折：退大5O-6QX；引物籬三#目建仲了江（三）定量原理定量原理：初始模板量的對數(shù)與C（T）循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系。初始DNA量越多，熒光達(dá)到某一值（域值）時 所需要的循環(huán)數(shù)越少。域值Ct值，熒光曲線由潛伏期進(jìn)入對數(shù)期的拐點(diǎn)。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系（如圖二）， 根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量圖一為PCR擴(kuò)增曲圖二為：原則曲線（四）TaqMan探針法TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是運(yùn)

5、用Taq酶的3p-5p外切核酸酶活性，切斷探針產(chǎn)生熒 光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合,因此熒光信號的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反映 體系中，涉及一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間.探針的5p端標(biāo) 記有報(bào)告基團(tuán)（Reporter，R），如FAM、VIC等，3p端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q），如TAMRA等。當(dāng)探 針完整的時候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸取，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸 過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3p-5p外切核酸酶活性就會將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)

6、，其能量不能被 吸取，即產(chǎn)生熒光信號。因此，每通過一種PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段同樣，有一種同步指數(shù)增長的過程。信 號的強(qiáng)度代表了模板DNA的拷貝數(shù)。二、質(zhì)量指標(biāo)熒光PCR質(zhì)量控制。一種好的成果必須有一種好的試劑，有合格的操作人員，有合格的環(huán)境等因素。（一）特異性一方面一種好的試劑要有特異性。目前臨床檢查用的試劑，都是規(guī)定國家藥監(jiān)局所批的試劑，因此它序列的特異 性都是通過專家所認(rèn)證的。但是用SYBR green染料進(jìn)行定量時，要注旨在放射學(xué)應(yīng)用之前或在擬定放射學(xué)是不是可用 時，要通過溶解曲線來對這個措施做一種特異性的評價。此外要注意交叉性的問題，特別是做細(xì)菌16sRNA的檢測，試 劑制備

7、是在國家嚴(yán)格規(guī)定的GMP廠房里生產(chǎn)。試劑出廠后運(yùn)送到檢測單位，她們使用的環(huán)境基本上不具有GMP廠房的條 件。因此如果檢測的試劑規(guī)定比較高，在GMP廠房或在一種原則的PCR實(shí)驗(yàn)室里面才干做的比較合格，而在一種既有的 實(shí)驗(yàn)室，雖然通過驗(yàn)收但是環(huán)境要比GMP廠房規(guī)定的環(huán)境差，因此兩個應(yīng)當(dāng)有同步性。就是說在GMP廠房好的條件下生 產(chǎn)的試劑，放到既有的實(shí)驗(yàn)室里面也應(yīng)當(dāng)?shù)玫酵瑯右环N實(shí)驗(yàn)成果。如果我們目前的實(shí)驗(yàn)條件浮現(xiàn)了交叉性的污染問題， 即我們環(huán)境里面就存在一種16sRNA這樣的菌株，那我們既有的檢測成果就沒有可靠性。（二）敏感性一種好的試劑要有好的敏感性。有的專家想通過增長模塊擴(kuò)增的量來提高敏感性，我們

8、覺得是不科學(xué)的，從低碳 的境地來講也是不科學(xué)的。目前我們所做的實(shí)驗(yàn)，加入模板的量是微量的，有的是3ul，有的是5ul，最多的是10ul。 常規(guī)的應(yīng)用PCR反映體系一般是3050ul。某些進(jìn)口的試劑用了 100ul，這樣成本實(shí)際價格也非常高。我們目前3050ul 的反映體系下，一般模板的量在510ul就足夠。如果從510ul變成了 1020ul，雖然可以提高1倍的敏感性。但是 里面的干擾物質(zhì)會相應(yīng)的增長，影響成果的精確性。（1）擴(kuò)增效率試劑自身的擴(kuò)增效率應(yīng)當(dāng)是最佳的擴(kuò)增效率，對檢測模板所設(shè)定的引物和探針的位置不唯一，它有好多位置，好 多序列都可以設(shè)計(jì)。但是在不同的區(qū)域設(shè)計(jì)的不同引物和探針，它擴(kuò)增

9、的效率也許有很大的差別。對于一種勢力雄厚或 有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)體公司常常是設(shè)計(jì)諸多條引物和探針，并且精確到個別堿基，然后通過理論、軟件，更重要要通過實(shí)踐的篩 選，篩選出活性效率比較最高的一套引物和探針來制作試劑。在整個PCR擴(kuò)增反映的效率和敏感性上，我們把它比方成 是跑步和跳高的關(guān)系。如圖三所示。這是典型的一種PCR擴(kuò)增實(shí)時熒光曲線，擴(kuò)了 45個循環(huán)。我們可以看到從擴(kuò)增的初期在沒有熒光 信號的狀況下逐漸擴(kuò)增，擴(kuò)增到12個循環(huán)后檢測到了陽性的擴(kuò)增信號，這個信號越來越放大，然后在10個信號左右達(dá) 到平臺期。這條藍(lán)線是基線即為CT值，從第一種循環(huán)到第十二循環(huán)沒有跑步，十二個循環(huán)之后開始跑，跑到近來也是 最快

10、的量是最大的。再上后整個模板里，含量最低的在最后，也達(dá)到了極限，這就是跑步。跳高就是達(dá)到平臺，量最大 的標(biāo)本，這個反映孔達(dá)到一種高平臺，量至少的反映孔也應(yīng)當(dāng)達(dá)到與量最大的同樣一種平臺度，這就是跳高。不管原始 模板量高中或低，一種好的試劑應(yīng)當(dāng)以同樣的比例和速率往前移，移到最快，即跑的最快同步跳的最高。最后含量最低 的這個反映孔也要跳到同樣的高度，這是一種好試劑的原則。曾經(jīng)對國內(nèi)的試劑進(jìn)行一種考核比較，發(fā)現(xiàn)同樣一種高中 低的模板，按照理論擴(kuò)增時，有的試劑擴(kuò)增效率開始跳的還很高，后來越跳越矮，這個實(shí)體生產(chǎn)廠家在探針設(shè)計(jì)合成或 它的質(zhì)量、比例、數(shù)量等有問題，Taq酶的活性也非常重要。圖三：Amplif

11、ication Plots（2） 添加劑添加劑，目前為了避免擴(kuò)增污染的，好多試劑公司，涉及衛(wèi)生臨檢中心也規(guī)定，在實(shí)驗(yàn)的反映體系要加入某些UNG 酶，UNG酶可以有效的防污染，但是UNG酶在防污染的同步在95C 35分鐘要對它進(jìn)行滅活，否則它會影響后 來的擴(kuò)增95C 35分鐘能不能把UNG酶滅活？后來我們做了某些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)95C5分鐘很難徹底的把UNG酶滅活， 因此它的存在對試劑的敏感性產(chǎn)生了影響，特別是對低拷貝反映孔的擴(kuò)增產(chǎn)生克制的作用。此外有關(guān)內(nèi)標(biāo)的問題，一種 好的實(shí)驗(yàn)成果，最重要的體目前反復(fù)性上，雖然敏感性越高越好，但是更重要的還是反復(fù)性，臨床醫(yī)生更注重同一種標(biāo) 本在不同次檢測應(yīng)當(dāng)獲得同樣一

12、種值，雖然在基因檢測里不也許達(dá)到完全相似，但至少要在一種范疇之內(nèi)。（三）反復(fù)性影響反復(fù)性的因素有諸多。第一，儀器間的差別，可以拿到臨床應(yīng)用的這些儀器間的差別不是特別大，但是在儀 器使用過程中會有好多影響因素。儀器使用不當(dāng)、電壓不穩(wěn)或維護(hù)不當(dāng)常常導(dǎo)致不同臺儀器的差別比較大。儀器的廠家 要及時對儀器進(jìn)行維護(hù)、保養(yǎng)。第二，輔助儀器，離心機(jī)、移液器等，對于微量的實(shí)驗(yàn)比較重要。對于需要離心、沉淀 或提純的實(shí)驗(yàn)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和定位時間要準(zhǔn)，離心機(jī)的校準(zhǔn)也非常重要。第三，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，涉及空間環(huán)境和構(gòu)造 環(huán)境，為了避免污染盡量要做一種物理的分割，也就是核酸的提取、擴(kuò)增和試劑配制要通過物理分割的方式分開。第四， 實(shí)驗(yàn)室的溫度，用Trizol試劑來沉淀或提取RNA，