蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、利用蠶豆根細(xì)胞微核技術(shù)檢測(cè)洗發(fā)水的毒性09生物技術(shù) 寧偉王曉剛太紅橋劉經(jīng)源摘 要 微核(micronucleus,MCN)是真核生物細(xì)胞經(jīng)各種理化因 子作用后引起染色體畸變，在間期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。在細(xì)胞間 期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/31/20, 染色與主核一樣或稍淺。一般認(rèn)為微核是由無著絲粒的染色體斷片或 落后染色體，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。 當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即 微核。1蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)(Micronucleustest,MC-NT)技術(shù)是一種 以染色體斷裂及紡錘絲損傷為測(cè)試終點(diǎn)的植物微核

2、檢測(cè)方法。它是一 種應(yīng)用于監(jiān)測(cè)環(huán)境致突變物對(duì)人體和其他生物體的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生危 害的技術(shù)，并從細(xì)胞遺傳學(xué)水平上探討植物遺傳物質(zhì)的改變狀況與環(huán) 境污染，也可以檢測(cè)淡水環(huán)境的質(zhì)量。2關(guān)鍵詞蠶豆根尖微核洗發(fā)水千分率蠶豆是一種很好的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料。它的染色體為六對(duì)相當(dāng) 大的染色體，而且根尖含有較多的分裂相細(xì)胞，非常適合顯微觀察。 目前，蠶豆根尖微核技術(shù)在環(huán)境致突變性檢測(cè)/監(jiān)測(cè)方面已經(jīng)形成了 一套完整的體系。它的可靠性和靈敏性較高，且本底較低，這對(duì)于一 種致突變性檢測(cè)方法是十分重要的。此外，它的檢測(cè)物譜較廣。目前 多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在鏡檢細(xì)胞微核時(shí)，應(yīng)按下列標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)微核：凡主核大小1/3以下，與主核分離的

3、小核；小核的著色與主核相當(dāng)或稍淺；小核形態(tài)可為圓形，不規(guī)則等。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆招Q豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)技術(shù)的一般方法。并利用蠶豆根尖細(xì) 胞微核檢測(cè)技術(shù)對(duì)洗發(fā)水的毒性狀況給出客觀的評(píng)價(jià)，同時(shí)表明蠶豆 根尖細(xì)胞MCN對(duì)脅迫很敏感，蠶豆根尖微核技術(shù)可用于洗漱用品的安 全監(jiān)測(cè)。材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料蠶豆種子、洗發(fā)水、顯微鏡、鑷子、培養(yǎng)皿、剪刀、載玻片、蓋 玻片、燒杯、Carnoys固定液、鹽酸酒精解離液、改良苯酚品紅染液、 NaN3 等。2.2毒液配制選取所測(cè)洗發(fā)水，按平時(shí)所用比例與水混合均勻。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1浸種擇飽滿、均勻的20粒種子，洗凈后用蒸餾水常規(guī)浸種24h，此 期至少換水2次；待種子充分

4、吸脹后，移入干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。 2.3.2催芽種子吸脹后，保持濕度，在室溫下催芽2天。2.3.3被檢測(cè)液處理根尖各取10粒，分別用蒸餾水(自來水)和毒液培養(yǎng)種子1天。2.3.4根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)處理后的種子用蒸餾水（自來水）浸洗3次，每次23 min； 將處理液洗凈后，置于干凈培養(yǎng)皿恢復(fù)2224h ；同時(shí)均設(shè)蒸餾水處 理為空白對(duì)照組。以上各步操作溫度均在25C下進(jìn)行。2.3.5根尖細(xì)胞固定將恢復(fù)后的種子，從根尖頂端切下1cm左右長(zhǎng)的幼根，用卡諾氏 液固定56h。2.3.6酸解用蒸餾水浸洗固定好的幼根3次，每次5min，吸凈蒸餾水，加 入鹽酸酒精解離液60C下酸解68min，幼根軟化即可。2.3

5、.7染色吸去鹽酸，用蒸餾水浸沒幼根3次，每次12分鐘。最后浸于 水中。制片前取出置載玻片上，截下12mm左右長(zhǎng)的根尖，滴1-2 滴改良苯酚品紅染液染色20min，之后方可壓片觀察。2.3.8壓片觀察對(duì)各種不同處理的根尖分生組織進(jìn)行常規(guī)壓片，每個(gè)處理各取3 個(gè)根尖壓片。在高倍鏡下觀察壓片根尖分生區(qū)細(xì)胞分散良好的區(qū)域， 并統(tǒng)計(jì)不少于1000個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)，然后再統(tǒng)計(jì)算出每個(gè)根尖的 MCN%。4結(jié)果3.1標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定對(duì)于蠶豆微核實(shí)驗(yàn)中微核千分率的計(jì)算可采用以下公式:MCN%。二某測(cè)試樣點(diǎn)（或?qū)φ战M）觀察到的MCN數(shù)/某測(cè)試樣點(diǎn)（或 對(duì)照組）觀察到的細(xì)胞數(shù)X1000%。對(duì)于污染指數(shù)（PI）的計(jì)算可采用以

6、下公式：PI=實(shí)驗(yàn)組MSN%。總數(shù)/對(duì)照組MSN%。總數(shù)污染指數(shù)（PI）判斷如果采用市售蠶豆種子，按規(guī)范操作標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件（其對(duì)照本底 為10%以下），其監(jiān)測(cè)樣品污染程度的劃分可采用“污染指數(shù)（PI）” 判斷。根據(jù)全國(guó)生物技術(shù)監(jiān)測(cè)規(guī)范一蠶豆根尖微核技術(shù)規(guī)定的污染 指數(shù)劃分標(biāo)準(zhǔn)，采用污染指數(shù)（PI）值來劃分受污染程度。此方法可 避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的MCN%本底的波動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)見表1。凡數(shù) 值在上、下限時(shí)定為上一級(jí)污染。表1污染指數(shù)PI值評(píng)價(jià)洗發(fā)水標(biāo)準(zhǔn)表污染指數(shù)PI值樣品污染等級(jí)0 1.5基本無污染1.5 2.0輕污染2.0 3.5中污染3.5以上重污染3.2結(jié)果在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中均可見到一定數(shù)量

7、的微核，也發(fā)現(xiàn)少量有絲 分裂期微核，各種染色體畸變等。根據(jù)鏡檢統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組 玻片以及對(duì)照組（蒸餾水）共計(jì)4個(gè)樣本的MCN%。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2）。表2洗發(fā)水安全指數(shù)MCN%?？倲?shù)PI污染指數(shù)對(duì)照組2.11 (1.42, 1.46, 3.45)一4.37 (3.52, 3.73, 5.86)2.07中污染二5.13 (4.51，4.71，6.17)2.43中污染三4.42 (3.57, 4.57, 5.12)2.09中污染結(jié)論：各樣品MCN%。差異不大，但都和對(duì)照組相比差異較顯著， 表明洗發(fā)水存在一定致突變性，且對(duì)人體有危害，但不是很大。討論從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析可看到，洗發(fā)水使蠶豆根尖細(xì)

8、胞產(chǎn)生微 核。微核試驗(yàn)是一種以染色體斷裂及紡綞絲損傷等為測(cè)試終點(diǎn)的植 物微核監(jiān)測(cè)方法，是監(jiān)測(cè)致突變性污染的一種經(jīng)濟(jì)快速方法。致突變 性和致癌高度相關(guān)，致突變污染物中可能存在致癌危險(xiǎn)物。通過實(shí)驗(yàn) 表明，洗發(fā)水也具有一定的致癌性。實(shí)驗(yàn)證明，微核試驗(yàn)作為一種監(jiān)測(cè)方法，是非常行之有效的。結(jié)語微核技術(shù)作為一種新興的生物科學(xué)短期測(cè)試方法，正在展示著 強(qiáng)大的生命力。當(dāng)然，蠶豆微核技術(shù)只適于測(cè)試潛在的染色體損傷因 子，其獲得的信息外推致突變物時(shí)任有一定的局限性。致突變物對(duì)蠶 豆作用的機(jī)制在分子和超顯微結(jié)構(gòu)水平上還缺乏知識(shí)，以及在不同條 件下出現(xiàn)的差異，材料選擇，方法應(yīng)用方面，都還有待進(jìn)一步深入研 究，統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。只有逐步做到規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、微量化之后，才能更 有效地發(fā)揮微核技術(shù)的優(yōu)越性。7參考文獻(xiàn)陳光榮，金波，李明等.蠶豆根尖微核技術(shù).見：環(huán)境監(jiān)測(cè) 技術(shù)規(guī)范第四冊(cè)生物(水環(huán)境部分)。國(guó)家環(huán)保局，1986,7578.金波、歐光鑒等，蠶豆根尖微核試驗(yàn)敏感品種的篩選華中 師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1984，(2)： 101108.陳光榮、金波、李明等.污染指數(shù)在微核技術(shù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)污染 中的應(yīng)用.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1986，6 (2)： 6063.陳光榮、金波、李明等.蠶豆葉尖細(xì)胞威嚇測(cè)定(MCNT)及 其監(jiān)測(cè)大氣污染的研究.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1988, 6 (2)： 38.陳光榮、金波、李明等.蠶豆細(xì)胞微核技