發(fā)光方法課件

1、發(fā)光技術(shù)原理及在環(huán)境研究中的應(yīng)用中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水化學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室常用的發(fā)光方法體系化學(xué)發(fā)光發(fā)光酶方法重組發(fā)光酶基因的工程菌方法發(fā)光菌方法化學(xué)發(fā)光分析中常用的發(fā)光體系魯米諾發(fā)光體系（LUMINOL+H2O2）過氧草酸鹽發(fā)光體系洛粉發(fā)光體系（LOPHINE）光澤精發(fā)光體系(LUCIGENIN)釕(II)-聯(lián)吡啶配合物發(fā)光體系LUMINOL化學(xué)發(fā)光體系氧化劑魯米諾催化劑+抑制劑Cu(II)Co(II)Zn(II).Cr(III).H2O2電極反應(yīng)Fe(CN)53-胺氨基酸醇磷酯膽堿.用LUMINOL化學(xué)發(fā)光體系測定重金屬濃度H2O2魯米諾+Cu(II)Co(II)Zn(II).Cr(I

2、II).SO2+隱蔽劑體系對象生物發(fā)光體系RCHOFMNH2FMNRCOOHO2hv+ATPLuciferinOxyluciferinAMPO2hv+發(fā)光菌螢火蟲細(xì)菌熒光素酶螢火蟲熒光素酶590 nm560 nm水母發(fā)光蛋白蚯蚓發(fā)光體系生物發(fā)光體系的應(yīng)用無細(xì)胞體系（發(fā)光酶）發(fā)光細(xì)胞體系（發(fā)光菌）閃爍記數(shù)器LUMINO光度計電荷偶合成象光子影象系統(tǒng)發(fā)光酶的核酸探針發(fā)光酶活性測定定量實(shí)時跟蹤實(shí)時跟蹤直接用螢火蟲發(fā)光酶構(gòu)建的典型發(fā)光體系熒光素氧化熒光素ATPAMP螢火蟲熒光素酶測定不同體系中細(xì)菌數(shù)測定系統(tǒng)能量代謝改變利用生物發(fā)光方法分析食品中微生物含量采樣過濾培養(yǎng)培養(yǎng)ATP提取發(fā)光Tanaka等發(fā)展

3、的快速微生物測定體系，1997發(fā)光酶提取劑高氯酸丁醇/辛醇加氯仿煮沸步驟費(fèi)時，有干擾，適合野外使用加TRIS緩沖液煮沸提取速度快，增強(qiáng)熒光，穩(wěn)定性差提取速度快，適合大批量樣品操作稀釋比較大，靈敏度受影響四種常用的ATP提取體系及優(yōu)缺點(diǎn)能夠降解苯系物的細(xì)菌(Pseudomonas putida)TOL 質(zhì)粒螢火蟲發(fā)光基因融合基因質(zhì)粒 pTSN316 重組大腸桿菌苯系物專屬型生物傳感器插入到xylS蛋白啟動子位置Kobatake, et al., Biosensors & Bioelectronics 1995， 10 ( 6-7): 601構(gòu)造帶有發(fā)光基因的微生物光功率計典型的細(xì)胞發(fā)光測試體系及

4、其應(yīng)用Hind IIIHind IIIPS IIBamH ISall2000800060004000Luxgene (Q67)Reconstracted Plasmid with Luxgene from V. Qinghainesis Q67(PACYC L184, 9000 bps, for recombinants of TA98 and TA100)cml朱文杰等., 1999將含發(fā)光酶基因的質(zhì)粒融合到細(xì)菌細(xì)胞中例：發(fā)光標(biāo)記熒光假單孢菌研究農(nóng)用稀土元素對土壤微生物的影響10000500菌密度稀土元素濃度黃褐土安徽農(nóng)大未發(fā)表數(shù)據(jù)，19991005稀土元素濃度紅壤用發(fā)光標(biāo)記方法跟蹤工程菌在

5、環(huán)境中的穩(wěn)定性和分布特性用標(biāo)記噬菌體監(jiān)測宿主細(xì)胞種類和密度根據(jù)原生動物/微生物(發(fā)光標(biāo)記)之間的捕/被食關(guān)系研究土壤微生物活性改變部分其他環(huán)境應(yīng)用用接種發(fā)光標(biāo)記微生物的方法研究植物根際動態(tài)用LUX報告基因融合方法研究化學(xué)品降解速率和途徑法國：DM，Microtox，fish, Ames不明確控制標(biāo)準(zhǔn)德國：Fish，Microtox，Algae, Ames, DM用獲得NOEC 的稀釋倍數(shù)控制愛爾蘭：Rainbow TroutTU1-25，取決于工業(yè)類型，每排放1TU需20倍稀釋1995年歐洲部分國家毒性排放控制標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)施細(xì)節(jié)（紅色部分是計劃1995年以后實(shí)施的項(xiàng)目）荷蘭：急慢性毒性，可降解性，

6、致突變性，富集性僅針對典型工業(yè)污染評價英國： Microtox， DM，Oyster, Algae.對不同工業(yè)類型測試種和復(fù)雜性不同瑞典：多指標(biāo)急慢性毒性，可降解性，致突變性，富集性針對工業(yè)類型分3個步驟挪威：多指標(biāo)急慢性毒性，可降解性，致突變性以過篩方式為主加拿大：Microtox, DM, Algae, Ames美國：全排水毒性控制方案CMC和CCC國家環(huán)保局生物監(jiān)測方法規(guī)范GB/T 12990-91水質(zhì): 微生物的PFU測試方法GB/T 15441-95水質(zhì): P. phosphoreum (T3) 急性毒性測試GB/T 13266-91水質(zhì): 大型蚤急性毒性測試GB/T 13267-9

7、1水質(zhì): 魚(Pinto)急性毒性測試發(fā)光菌的分類(P. Baimann)將4保存的斜面菌種轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上22培養(yǎng)24h接種到50 mL液體培養(yǎng)基中22振蕩（180r/min）培養(yǎng)1618h2000 r/min 離心10分鐘收集菌體并用蒸餾水制成菌懸液調(diào)整菌液濃度取0.1ml菌懸液加入到0.9ml樣品或空白溶液中混勻后反應(yīng)20分鐘，測樣品和空白的發(fā)光強(qiáng)度利用發(fā)光菌測試毒性時一般操作規(guī)程CEC50發(fā)光抑制（%）Log CEC50發(fā)光抑制（%）Log 稀釋度EC50發(fā)光抑制（%）Log CEC50Log 發(fā)光菌毒性實(shí)驗(yàn)中的劑量/效應(yīng)關(guān)系Vibrio qinghaiensis sp. nov. Q

8、-67毒性測試方法的開發(fā)過程從青海湖裸鯉體表分離得到發(fā)光菌篩選出Q-67表型特性發(fā)光特性生理生化特性致病特性環(huán)境因素影響測試范圍考察應(yīng)用范圍考察方法應(yīng)用推廣質(zhì)量保證測試方法規(guī)范朱文杰., 1992;馬梅,1998天然水體中陰(A)、陽 (B) 離子對Vibrio qinghaiensis sp. nov. Q-67發(fā)光的影響-300-200-1000100200-3-2-1012345Log Conc. ( mg/L)CaCl2KClMgCl2NaClRelative Luminescence (%)-200-150-100-5005010000.511.522.533.54Log Conc.

9、 ( mg/L)Na2SO4 NaCl NaHCO3NaNO3AB02468101214160102030405060反應(yīng)時間 (min)EC50 (Cu-CuSO4, mg/L)1340萬670萬340萬170萬確定發(fā)光測試方法的實(shí)驗(yàn)條件：菌液密度和反應(yīng)時間(pH was adjusted by 0.1 M NaOH or HCl, solution with pH 7 was used as control.)-20.00.020.040.060.080.0100.04567891011pH相對光損耗(%)確定發(fā)光測試方法的實(shí)驗(yàn)條件：pH的影響應(yīng)用Q67發(fā)光菌測定不同金屬離子的毒性Hg N

10、i Cd Cu Mn Zn應(yīng)用發(fā)光菌研究復(fù)合污染過程的毒性變化重金屬離子的聯(lián)合毒性(Vibro Qinhainesis Q67測試，等毒性設(shè)計)Zn+HgCd+HgCu+HgCd+Zn+CuCd+ZnCd+Hg+ZnCd+CuCu+ZnCu+Hg+ZnCu+Cd+Hg11LCLCLCLCTEILCLC50exp50,A50,B50,N50exp50obs=+=-abn-122-1TEITEI劉清., 19972,5-DCP020406080100-1-0.500.512,3-DCP050100-1-0.500.513-CP05010000.511.522,4,5-TCP050100-2-1.5

11、-1-0.502,3,4,5-TCP-20020406080100-2-1.5-1-0.5應(yīng)用Q67發(fā)光菌測定不同取代氯酚的毒性Log C (mg/L)童中華., 1997EC50= 3611e-2.4log P0246810121422.533.544.55log PEC50應(yīng)用發(fā)光菌研究取代氯酚的結(jié)構(gòu)/毒性關(guān)系 六種主要國產(chǎn)農(nóng)藥對Q-67和T-3 的毒性(mg.l-1)殺菌劑殺蟲劑童中華., 19970100200300400500600700乙磷鋁五氯硝基苯三唑酮涕滅威滅幼脲單甲脒Q67T3Q67和T3發(fā)光菌測定農(nóng)藥毒性的比較 14種主要國產(chǎn)染料對Q-67的毒性(mg.l-1)童中華.,

12、 1997204060801000306090放置時間(小時)相對毒性（%）還原深藍(lán)VB還原直接黑向還原紅應(yīng)用發(fā)光菌研究電化學(xué)方法去除染料毒性的效果處理時間（分）童中華., 1997上海市地方標(biāo)準(zhǔn)：健康型建筑內(nèi)墻涂料生物毒性指數(shù)（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)DB31/TXXX-1998,）將涂料按比例稀釋(可使用適當(dāng)助劑溶解)將涂料稀釋成系列濃度用超聲波勻漿器處理5分鐘（4C，相對濕度40%）測定發(fā)光菌毒性測定發(fā)光菌毒性樣品暴露1小時計算生物毒性指數(shù)DRT=(EC50-EC50)/EC50TIP=100(TU2+DRT2)1/2 EC50(mg/l)EC50(mg/l)DRTTUTIPA 102.00185.00

13、0.450.0145B 407.00515.000.210.0021C 489.00614.000.200.0020D 172.00345.000.500.0150E 229.00 444.000.480.0048F 374.00531.000.300.0030G 164.00344.000.520.0152H 116.00214.000.460.0146I 640.00671.000.050.005幾種北京市場上銷售的內(nèi)墻涂料毒性測試結(jié)果（P. Phosphoreum T3)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：TIP 10馬梅., 1999?？诒P龍廟沽口中洲戴村虎山蔡家灣洎水河黃龍廟L01L03L04L05L07L08L08L09洎水河口L06大塢河樂安江0102030405060708090100A01A04A05J.R.A07A08A13A14采樣點(diǎn)相對抑制率（）T3Q67應(yīng)用發(fā)光菌研究江西樂安江水質(zhì)毒性的沿程變化J.R012A01A03A04A05J.R.A07A08A09A13A14毒性單位（TU）94.1093.6 應(yīng)用發(fā)光菌研究江西樂安江水質(zhì)毒性的時空變化?？诒P龍廟沽口中洲戴村虎山蔡家灣洎水河黃龍廟L01L03L04L05L07L08L08L09洎水河口L06大塢河樂安江帶有發(fā)光基因的固定化細(xì)胞光功率計放