分子雜交的技術(shù)

1、關(guān)于分子雜交技術(shù)第1頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四第一節(jié) 分子雜交的原理核酸分子雜交（nucleic acid hybridization） 指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。 分子雜交是通過(guò)配對(duì)堿基對(duì)之間的非共價(jià)鍵（主要是氫鍵）結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈 第2頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四不同來(lái)源的DNA或RNA單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子雜交分子

2、 若所用的核酸探針的片段較長(zhǎng)(幾百個(gè)核苷酸以上)，可以得到很準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。但若人工合成的寡核苷酸探針片段較短（如2030個(gè)核苷酸），則難免會(huì)出現(xiàn)準(zhǔn)確性差的假陽(yáng)性現(xiàn)象。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱(chēng)探針。第3頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四雜交的雙方：探針和要檢測(cè)的核酸。 將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針和被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。被檢測(cè)的核酸： 克隆化的基因組DNA 提純的 細(xì)胞總DNA 細(xì)胞內(nèi)雜交（細(xì)胞原位雜交） 細(xì)胞總RNA第4頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四變性

3、復(fù)性 DNA-DNA雜交雙鏈分子第5頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四 雜交過(guò)程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。第6頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四一、DNA變性與復(fù)性（一）DNA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程，稱(chēng)DNA變性2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。第7頁(yè)，共5

4、0頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3第8頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱(chēng)復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第9頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四2、復(fù)性過(guò)程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙

5、鏈重新解離（3）局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子第10頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四二. 分子雜交的一般程序 待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜 交去除未參與雜交的探針檢 測(cè) 雜 交 信 號(hào)制備探針核酸片段探 針 標(biāo) 記加入標(biāo)記核酸探針 電泳第11頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。第12頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四三、 核酸探針的制備探針（Probe)的概念: 一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或

6、目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。第13頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四1.探針的制備方法長(zhǎng)度一般以50300bp為宜，有時(shí)達(dá)1.5kb。制備方法： (1) DNA重組技術(shù) (2) PCR擴(kuò)增 (3) 化學(xué)合成第14頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四2. 探針的分類(lèi) 據(jù)來(lái)源及性質(zhì)不同可分為： (1) 基因組DNA探針 (2) cDNA探針 (3) RNA探針 (4) 寡核苷酸探針第15頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四合成寡核苷酸探針注意原則(1) 長(zhǎng)度（10-50 bp); (2) G:C對(duì)含量40%-60%；(3)

7、 探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) 與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。第16頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四3 . 核酸探針的標(biāo)記 為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。第17頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四 標(biāo)記的種類(lèi) 同位素： 32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針?lè)峭凰兀?生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物 第18頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四第二節(jié) 核酸分子雜交的方法按其分子種類(lèi)劃分（1）Sou

8、thern印跡雜交（2）Northern印跡雜交3） Western印跡雜交第19頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶S1保護(hù)分析法第20頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四一、Southern雜交其基本原理是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)。通過(guò)Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長(zhǎng)度。DNA經(jīng)電泳后，從凝膠中

9、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。利用這一技術(shù)可進(jìn)行克隆基因DNA的酶切圖譜分析，基因組中某一基因的定性與定量分析、基因點(diǎn)突變及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分性等。第21頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四步驟：酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 (3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 (5) 通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。 第22頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5

10、月20日，11點(diǎn)13分，星期四帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術(shù)流程第23頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（一）待測(cè)核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段第24頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶。 第25頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20

11、日，11點(diǎn)13分，星期四 （三）凝膠中核酸的變性（堿變性） 分子量超過(guò)10kb的較大的DNA片段，需要很長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間。必須將最長(zhǎng)的DNA片段控制在大約2kb以下。如果靶序列5kb，則需進(jìn)行脫嘌呤處理（ DNA產(chǎn)生缺口將提高轉(zhuǎn)移的質(zhì)量）。把凝膠浸在0.25mol/LHCl中，室溫輕輕晃動(dòng)，直到溴酚藍(lán)從藍(lán)變黃。 注意：處理人類(lèi)基因組DNA10分鐘；處理植物基因組DNA20分鐘。 再 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中第26頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四如果靶序列5kb，則直接進(jìn)行下面的步驟 (1) 把凝膠浸在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室溫215

12、分鐘，輕輕晃動(dòng)。 (2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中 (3) 把凝膠浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，Ph7.5，1.5mol/L NaCl），室溫215分鐘。 (4) 在20SSC中平衡凝膠至少10分鐘。第27頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（四）Southern印跡高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長(zhǎng)用）上，烘干固定后即可用于雜交本方法由Southern發(fā)明,故又稱(chēng)為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)第28頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（1）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中

13、的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上第29頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四第30頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四白瓷盤(pán)玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜第31頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱第32頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月

14、20日，11點(diǎn)13分，星期四（2）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過(guò)凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。第33頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四第34頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(109 cpm/g)互補(bǔ)DNA。如果將10g基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過(guò)夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小

15、的單拷貝序列。第42頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析第43頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四二、Northern印跡雜交原理：Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開(kāi)來(lái)，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強(qiáng)度

16、則可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。第44頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四 1、鑒別RNA 2、探針可用DNA或RNA片段 3、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA第45頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四Northern印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn)1. 總RNA不需要進(jìn)行酶切，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳； 2、變性：RNA電泳前加熱變性，電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。DNA電泳前和

17、電泳 中不變性 3、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理。在烘烤前RNA與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會(huì)被洗脫。第46頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四 4、靶核酸為RNA5. Northern也可檢測(cè)目標(biāo)mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測(cè)目的基因在組織細(xì)胞中有無(wú)表達(dá)及表達(dá)的水平如何第47頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)13分，星期四步驟1. 總RNA提取2. 變性膠的制備：5甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛等制備瓊脂糖凝膠3. 樣品變性：取總RNA加入5甲醛凝膠電泳緩沖液l、37%甲醛、甲酰胺，變性4. 電泳5. 將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：6.膜置80，