蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1、 .wd. .wd. .wd.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、目的：了解等電點(diǎn)的意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉能力的關(guān)系。初步學(xué)會測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的 基本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。二、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電當(dāng)固體與液體接觸時，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進(jìn)入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號的電荷，由于電中性的要求，帶電外表附近的液體中必有與固體 HYPERLINK :/baike.baidu /view/3872524.htm t _blank 外表電荷數(shù)量相等但符號相反的多余的反離子。在界面上帶電外表和反離子形成了雙電層的構(gòu)造。在兩種不

2、同物質(zhì)的界面上，正負(fù)電荷分別排列成的面層。對于雙電層的具體構(gòu)造，一百多年來不同學(xué)者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了擴(kuò)散雙電層模型；后來Stern又提出了Stern模型。根據(jù)O.斯特恩的觀點(diǎn)，一局部反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引作用例如范德華力而和外表嚴(yán)密結(jié)合，構(gòu)成 HYPERLINK :/baike.baidu /view/643702.htm t _blank 吸附層或稱嚴(yán)密層、斯特恩層。其余的離子那么擴(kuò)散地分布在溶液中，構(gòu)成雙電層的 HYPERLINK :/baike.baidu /

3、view/1169706.htm t _blank 擴(kuò)散層或稱滑移面。由于帶電外表的吸引作用，在 HYPERLINK :/baike.baidu /view/1169706.htm t _blank 擴(kuò)散層中反離子的濃度遠(yuǎn)大于同號離子。離外表越遠(yuǎn)，過剩的反離子越少，直至在溶液內(nèi)部反離子的濃度與同號離子相等。嚴(yán)密層：溶液中反離子及溶劑分子受到足夠大的靜電力，范德華力或特性吸附力，而嚴(yán)密吸附在固體外表上。其余反離子那么構(gòu)成擴(kuò)散層?；瑒用妫褐腹桃簝上喟l(fā)生相對移動的界面，是凹凸不平的曲面?；瑒用嬷寥芤罕倔w間的電勢差稱為電勢。固體顆粒帶電量的大小及測量方式電勢只有在固液兩相發(fā)生相對移動時才能呈現(xiàn)出來。電

4、勢的大小由Zeta電位表示，其數(shù)值的大小反映了膠粒帶電的程度，其數(shù)值越高說明膠粒帶電越多，擴(kuò)散層越厚。一般來說，以pH值為橫坐標(biāo)，Zeta電位為縱坐標(biāo)作圖，Zeta電位為零對應(yīng)的pH值即為等電點(diǎn)。對于蛋白質(zhì)分子來說：蛋白質(zhì)分子的大小在 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E8%83%B6%E7%B2%92&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 膠粒范圍內(nèi)，約1100微米。大局部蛋白質(zhì)分子的外表都有很多親水集團(tuán)，這些集團(tuán)以 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E6%B0%A2%E9%94%AE&hl_t

5、ag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 氫鍵形式與 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E6%B0%B4%E5%88%86%E5%AD%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 水分子進(jìn)展 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E6%B0%B4%E5%90%88%E4%BD%9C%E7%94%A8&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 水合作用，使 HYPERLINK :/ baidu /

6、s?wd=%E6%B0%B4%E5%88%86%E5%AD%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 水分子吸附在蛋白質(zhì)分子外表而形成一層水合膜，具有 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E4%BA%B2%E6%B0%B4%E6%80%A7&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 親水性；又由于蛋白質(zhì)分子外表的親水集團(tuán)都帶有電荷，會與極性 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E6%B0%B4%E5%88%86%E5%AD%90&hl_tag

7、=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 水分子中的異性電荷吸引形成 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E5%8F%8C%E7%94%B5%E5%B1%82&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 雙電層。而水合膜和 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E5%8F%8C%E7%94%B5%E5%B1%82&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 雙電層的存在，使蛋白質(zhì)的分子與分子之間不會相互凝聚，

8、成為比較穩(wěn)定的 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E8%83%B6%E4%BD%93%E6%BA%B6%E6%B6%B2&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 膠體溶液。如果消除水合膜或 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E5%8F%8C%E7%94%B5%E5%B1%82&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 雙電層其中一個因素，蛋白質(zhì)溶液就會變得不穩(wěn)定，兩種因素都消除時，蛋白質(zhì)分子就會互相凝聚成較大的分子而產(chǎn)生沉淀。在生活實(shí)踐中，常

9、利用蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)沉淀或別離蛋白質(zhì)。如做豆腐、 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E8%82%89%E7%9A%AE%E5%86%BB&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 肉皮凍就是利用蛋白質(zhì)的 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E8%83%B6%E5%87%9D%E4%BD%9C%E7%94%A8&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 膠凝作用。蛋白質(zhì)分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關(guān)系，蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在酸性溶液中的氨基酸

10、分子氨基形成-NH3+而帶正電，在堿性溶液中羧基形成-COO-而帶負(fù)電：蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)PI。其定義為：在某一pH的溶液中，蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離子的趨勢或程度相等時，呈電中性，此時溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電點(diǎn)的應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的別離、提純和電泳。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測量方式：溶解度最低時的溶液pH。在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都不

11、一樣，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)是4.74.8，血紅蛋白等電點(diǎn)為6.76.8，胰島素是5.35.4，魚精蛋白是一個典型的堿性蛋白，其等電點(diǎn)在pH 12.012.4。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值，這個方法雖然不很準(zhǔn)確，但在一般實(shí)驗(yàn)條件下都能進(jìn)展，操作也簡便。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)比較準(zhǔn)確的方法是采用等電聚焦技術(shù)加以準(zhǔn)確測定，但需一定的實(shí)驗(yàn)條件。 HYPERLINK :/baike.baidu /view/2087271.htm t _blank 等電聚焦 HYPERLINK :/baike.baidu /view/251

12、10.htm t _blank 電泳IEF，isoelectric focusing electrophoresis利用特殊的一種 HYPERLINK :/baike.baidu /view/901429.htm t _blank 緩沖液 HYPERLINK :/baike.baidu /view/1149746.htm t _blank 兩性電解質(zhì)在 HYPERLINK :/baike.baidu /view/65842.htm t _blank 凝膠常用 HYPERLINK :/baike.baidu /view/585364.htm t _blank 聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)制造一個 HYPER

13、LINK :/baike.baidu /view/307864.htm t _blank pH HYPERLINK :/baike.baidu /view/454441.htm t _blank 梯度， HYPERLINK :/baike.baidu /view/25110.htm t _blank 電泳時每種 HYPERLINK :/baike.baidu /view/15472.htm t _blank 蛋白質(zhì)就將 HYPERLINK :/baike.baidu /view/621740.htm t _blank 遷移到等于其 HYPERLINK :/baike.baidu /view/2

14、6521.htm t _blank 等電點(diǎn)pI的pH處此時此 HYPERLINK :/baike.baidu /view/15472.htm t _blank 蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù) HYPERLINK :/baike.baidu /view/63129.htm t _blank 電荷，形成一個很窄的區(qū)帶。IEF的 基本原理在IEF的 HYPERLINK :/baike.baidu /view/25110.htm t _blank 電泳中，具有pH HYPERLINK :/baike.baidu /view/454441.htm t _blank 梯度的 HYPERLINK :/baike.

15、baidu /view/298837.htm t _blank 介質(zhì)其分布是從 HYPERLINK :/baike.baidu /view/767315.htm t _blank 陽極到 HYPERLINK :/baike.baidu /view/820711.htm t _blank 陰極，pH值逐漸增大。如前所述， HYPERLINK :/baike.baidu /view/15472.htm t _blank 蛋白質(zhì)分子具有 HYPERLINK :/baike.baidu /view/2604023.htm t _blank 兩性解離及 HYPERLINK :/baike.baidu /

16、view/26521.htm t _blank 等電點(diǎn)的特征，這樣在 HYPERLINK :/baike.baidu /view/771396.htm t _blank 堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶 HYPERLINK :/baike.baidu /view/532077.htm t _blank 負(fù)電荷向 HYPERLINK :/baike.baidu /view/767315.htm t _blank 陽極移動，直至某一pH位點(diǎn)時失去電荷而停頓移動，此處 HYPERLINK :/baike.baidu /view/298837.htm t _blank 介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)pl

17、。同理，位于 HYPERLINK :/baike.baidu /view/1212447.htm t _blank 酸性區(qū)域的 HYPERLINK :/baike.baidu /view/15472.htm t _blank 蛋白質(zhì)分子帶正 HYPERLINK :/baike.baidu /view/63129.htm t _blank 電荷向 HYPERLINK :/baike.baidu /view/820711.htm t _blank 陰極移動，直到它們的 HYPERLINK :/baike.baidu /view/26521.htm t _blank 等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?/p>

18、， HYPERLINK :/baike.baidu /view/26521.htm t _blank 等電點(diǎn)是蛋白質(zhì) HYPERLINK :/baike.baidu /view/1264203.htm t _blank 組分的特性 HYPERLINK :/baike.baidu /view/892422.htm t _blank 量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物參加有pH HYPERLINK :/baike.baidu /view/454441.htm t _blank 梯度的 HYPERLINK :/baike.baidu /view/65842.htm t _blank 凝膠 HYPERL

19、INK :/baike.baidu /view/298837.htm t _blank 介質(zhì)中，在 HYPERLINK :/baike.baidu /view/63151.htm t _blank 電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成別離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。沉淀反響：蛋白質(zhì)在某種理化條件下，蛋白 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E8%83%B6%E4%BD%93&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 膠體溶液的水化層或者電荷層破壞，蛋白 HYPERLINK :/ baidu /s?w

20、d=%E8%83%B6%E4%BD%93&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 膠體相互聚集的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有1 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E7%9B%90%E6%9E%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 鹽析：在蛋白質(zhì)水溶液中參加足量的鹽類如 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E7%A1%AB%E9%85%B8%E9%93%B5&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t

21、 _blank 硫酸銨，可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)的活性。這是一個可逆的過程，可用于蛋白質(zhì)的別離與初級提純。2變性：在重金屬鹽、強(qiáng)酸、 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E5%BC%BA%E7%A2%B1&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 強(qiáng)堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質(zhì)某些理性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失。這是一個不可逆過程。3參加一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，破壞水化膜，短時間內(nèi)是可逆反響；4參加生物堿試劑含氮的堿性物質(zhì)：能使生物堿沉淀或作用產(chǎn)生顏色反響

22、的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。當(dāng)溶液的pH小于PI時，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結(jié)合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白質(zhì)的主要成分，常溫下在水中可溶解0.81.2%，微溶于25度水和有機(jī)溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分。當(dāng)浸入水中那么迅速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為復(fù)雜，沒有確定的分子式。分子量約為57000375000，在牛奶中約含3%，占牛奶蛋白質(zhì)的80%。三、器材及試劑：1器材：試管1.5厘米9。吸管1毫升2，2毫升2，10毫升2。容量瓶50毫升2，500毫升1。試管架。2試劑：0.01molL-1醋酸溶液。0.1molL-1醋酸溶液。1 molL-1

23、醋酸溶液。1 molL-1氫氧化鈉溶液氫氧化鈉和醋酸溶液的濃度要標(biāo)定。酪蛋白。四、操作步驟：1制備蛋白質(zhì)膠液1稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，參加402參加50毫升1 molL-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質(zhì)完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸餾水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶。3在容量瓶中再參加1 molL-1醋酸溶液50毫升，搖勻。4參加蒸餾水定容至500毫升，得到略現(xiàn)渾濁的，在0.1 molL-1NaAC溶液中的酪蛋白膠體。2等電點(diǎn)測定按下表順序在各管中參加蛋白質(zhì)膠液，并準(zhǔn)確地參加蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液，參加后立即搖勻。管號蛋白質(zhì)膠液(毫升)H2O(毫升)0

24、.01molL-1HAC(毫升)0.1molL-1HAC毫升1molL-1HAC毫升pH觀 察0分鐘10分鐘20分鐘1234567891111111118.387.758.758.508.007.005.001.007.400.621.250.250.501.002.004.008.001.605.95.65.35.04.74.44.13.83.5觀察各管產(chǎn)生的混濁并根據(jù)混濁度來判斷酪蛋白的等電點(diǎn)。觀察時可用+，+，+，表示渾濁度。3. 蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)1蛋白質(zhì)的鹽析在試管里參加12毫升蛋白質(zhì)的水溶液，然后逐滴參加硫酸銨飽和溶液，觀察現(xiàn)象，有無白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動試管，現(xiàn)象不明顯時，

25、多加幾滴硫酸銨飽和溶液。2蛋白質(zhì)的變性在試管里參加2毫升蛋白質(zhì)的水溶液，沸水浴加熱5分鐘，觀察現(xiàn)象。把試管里的下層物質(zhì)取出一些放在水里，觀察現(xiàn)象。在試管里參加3毫升蛋白質(zhì)的水溶液，參加1毫升硫酸銅溶液，觀察現(xiàn)象。有無淡藍(lán)色絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生。把少量沉淀放入盛有蒸餾水的試管里，觀察沉淀是否溶解。五、思考題1、在等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)的溶解度為什么最低請結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)加以說明。在 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E7%AD%89%E7%94%B5%E7%82%B9&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子以 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E4%B8%A4%E6%80%A7%E7%A6%BB%E5%AD%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t _blank 兩性離子形式存在，其分子 HYPERLINK :/ baidu /s?wd=%E5%87%80%E7%94%B5%E8%8D%B7&hl_tag=textlink&tn=