PCR技術(shù)及其應(yīng)用 (2)課件

1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用微生物組 lssPCR技術(shù)進展PCR工作方式PCR原理DNA結(jié)構(gòu)PCR簡史DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)AT氫鍵GC氫鍵嘌呤嘧啶PCR技術(shù)簡史1971年，Khorana及其同事提出-修復復制測序、引物合成的困難，Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘了設(shè)想 PCR技術(shù)原理和工作方式PCR的基本原理PCR：Polymerase Chain Reaction 類似于DNA的體內(nèi)復制退火Primer 1Primer 25355353350Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸72Ta

2、rget SequenceTarget Sequence每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增最后

3、一步 : 72 5-10 min2530個循環(huán)后?PCR技術(shù)的特點(1) 高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍(2) 特異性引物引物技術(shù)流程： 模板獲取 引物設(shè)計 體系建立 PCR擴增 結(jié)果鑒定 體系優(yōu)化 PCR的實施DNA提?。悍勇确路ㄈ蚪MDNA提?。喝咏M織研磨儀破碎抽提DNA沉淀DNA 核酸提取儀（二）引物的設(shè)計 5端引物 3端引物 引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度下游53上游編碼鏈1. 引物設(shè)計的基本要求：（1）引物長度: 1530 bp（2）堿基 隨機（3）單條自身不互補（4）兩條引物間不互補全部人類基因組約有2.91G bp，約

4、有39000個基因；平均的基因大小有27k bp2.引物設(shè)計軟件primer premier 5.0的使用（三）PCR反應(yīng)體系的建立與條件控制DNA擴增體系（25l） 10Buffer (Mg2+) 2.5l 模板DNA 1l Taq酶（5u/ul） 0.51u dNTP (10mM) 0.51l primer1(10M) 0.51l primer2(10M) 0.51l ddH2O 補齊至25ul經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 5min4 1-2hrPCR儀PCR結(jié)果分析1. 凝膠電泳電荷效應(yīng)DNA帶負電分子篩作用凝膠2 成像

5、EB嵌入DNA雙鏈 紫外線照射成像 （2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 適宜分離的片斷：500bp的DNA或RNAPCR產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。(膠回收)PCR產(chǎn)物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，利用連接酶將PCR產(chǎn)物連接到載體如pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。2. PCR產(chǎn)物測序鑒定 ABI prism 310型基因分析儀(即DNA測序儀)是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號 。實用PCR技術(shù)定性PCR熒光定量PCR實用PCR技術(shù)定性PCR樣品模板DNAPCR擴增跑電泳目的片段檢出未檢出熒光定量PCR實用PCR技術(shù)樣品模板DNA熒光定量PCR樣品中目的片段的拷貝數(shù)熒光定量PCR的概念PCR產(chǎn)物熒光物熒光信號檢測器曲線TheoreticalRealityLog Target DNA樣品拷貝數(shù)熒光定量PCR熒光定量PCR非特異性熒光染料法特異性熒光探針法SYBR Green 1Taq man 探針TaqMan熒光探針特異性熒光雙標記探針Taq酶 53外切酶活性PCR檢測新