骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子對(duì)臍血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究

1、骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞因子對(duì)臍血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究 毛平曾進(jìn)龍王彩霞杜慶華【摘要】為了討論胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞FBS結(jié)合細(xì)胞因子對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞N中D133+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用，將新穎臍血B中別離出來(lái)的N接種于無(wú)血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)14天。實(shí)驗(yàn)分為4組：組為空白對(duì)照組，不含基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子；S組為單用基質(zhì)細(xì)胞組；F組為單用細(xì)胞因子組；SF組為結(jié)合使用基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子組。在第0，6，10及14天檢測(cè)有核細(xì)胞總數(shù)、D133+細(xì)胞數(shù)及集落形成單位FU數(shù)。結(jié)果說(shuō)明：各時(shí)間點(diǎn)SF組有核細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均高于其它組；除了第14天外，SF組在第6、10天時(shí)D133+細(xì)胞數(shù)、FU數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均高

2、于其它組。結(jié)論：胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)延緩造血細(xì)胞的分化具有重要的作用，基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞因子可以有效的擴(kuò)增臍血單個(gè)核細(xì)胞及其中的D133+細(xì)胞，這是一種比較接近于臨床移植要求的造血細(xì)胞體外擴(kuò)增方法?！娟P(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)細(xì)胞；造血干細(xì)胞；細(xì)胞擴(kuò)增；D133+細(xì)胞；臍血；細(xì)胞因子InVitrExpansinfrdBldD133+ellsSupprtedbyBnearrStralellsandytkinesKeyrdsbnearrstralell;heatpietisteell;ellexpansin;D133+ell;rdbld;ytkineD34是目前造血干細(xì)胞HS最常用的外表抗原標(biāo)志。隨著對(duì)HS研究

3、的深化，人們發(fā)現(xiàn)存在D34抗原尚未表達(dá)的造血干細(xì)胞1，又發(fā)現(xiàn)部分A133可能是比D34更早表達(dá)的外表抗原2，3，在第七屆人類白細(xì)胞分化抗原大會(huì)上A133正式命名為D133，D133+細(xì)胞比D34+細(xì)胞具有更高的增殖和自我更新才能4。我們利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的人胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞因子的造血細(xì)胞體外培養(yǎng)體系5，以臍血N為起始細(xì)胞，研究臍血D133+細(xì)胞的體外擴(kuò)增潛能。材料和方法主要試劑和儀器中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志JExpHeatl2022;15(2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞因子對(duì)臍血D133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層的建立臍血N的制備足月妊娠的安康產(chǎn)婦臍血，經(jīng)病人及家屬知情同意后

4、取自本院，共10份，ADA抗凝。所采臍血在4小時(shí)內(nèi)按41體積比與HES混勻之后靜置30-45分鐘沉淀紅細(xì)胞，汲取上清經(jīng)Fill密度梯度離心別離出單個(gè)核細(xì)胞N，用PBS洗滌3次后備用。臍血N的液體培養(yǎng)體系及實(shí)驗(yàn)分組采用SteSpanT無(wú)血清培養(yǎng)體系，SF、FL、TP的終濃度均為50ng/l。實(shí)驗(yàn)分為4組：組：空白對(duì)照組，僅有培養(yǎng)基+N；S組：基質(zhì)細(xì)胞+N；F組SF+FL+TP+N;SF組：基質(zhì)細(xì)胞+SF+FL+TP+N。臍血N的接種密度為1106/l，置37、5%2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在第6、10、14天進(jìn)展半量換液，檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)和FU數(shù)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)D133表達(dá)的情況。所得數(shù)值與第

5、0天數(shù)值為1.00的相應(yīng)數(shù)值作比較。造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)細(xì)胞外表標(biāo)志的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)統(tǒng)計(jì)處理用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，結(jié)果以SD表示，差異顯著性采用方差分析。結(jié)果胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層的建立胚胎骨髓細(xì)胞經(jīng)全量換液后，貼壁細(xì)胞經(jīng)7-9天培養(yǎng)后即到達(dá)80%交融，主要為長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞，原代細(xì)胞尚可見(jiàn)少量圓形貼壁細(xì)胞及黏附于貼壁細(xì)胞外表的造血細(xì)胞。經(jīng)2次傳代以后成纖維細(xì)胞得以純化，呈平行或旋渦狀生長(zhǎng)。經(jīng)射線照射后，基質(zhì)細(xì)胞能在StespanTSFE無(wú)血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)18-20天而不發(fā)生脫落，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活力95%。臍血、N、D133+細(xì)胞數(shù)所采集臍血的容量平均為65.7l(52-92l),搜

6、集的N數(shù)為1.21.3108個(gè)，新穎臍血N中D133+細(xì)胞的所占比例為0.920.31%。培養(yǎng)過(guò)程中有核細(xì)胞總數(shù)的變化在一樣的時(shí)間點(diǎn)里，SF組有核細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均比其它組要高P0.05附表。D133+細(xì)胞數(shù)變化組、F組D133+細(xì)胞數(shù)雖然在第6天都有所增加，但之后即第10天和第14天均已低于初始程度，組在第14天D133+細(xì)胞根本已經(jīng)消耗殆荊S組和SF組在第6天，第10天都保持著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，S組在第6天、第10天分別為第0天值的4.061.44倍和4.511.87倍，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)顯著性P0.05，第14天回落至第0天的1.600.85倍，比第6天和第10天都要低P0.05。SF組在

7、第6天到達(dá)組內(nèi)峰值，為第0天值的14.493.41倍，在第10天有所回落，但仍為第0天值的10.433.31倍，但在第14天快速下降，為第0天值的1.190.53倍。除了在第14天SF組與S組擴(kuò)增的倍數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)差異P0.05，SF組在第6天、第10天的擴(kuò)增倍數(shù)均比其它各組在一樣時(shí)間點(diǎn)要高出許多P0.05附表。各組培養(yǎng)后FU數(shù)的變化各組在第6天、第10天FU數(shù)都有所增加，但組在第14天已觀察不到FU。F組在第14天回落至大致第6天程度P0.05。S組在培養(yǎng)過(guò)程中FU數(shù)一直在增加，第14天到達(dá)組內(nèi)最高值，為第0天值的17.463.42倍，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較P值均0.01。SF組在第10天FU數(shù)到達(dá)組內(nèi)

8、最高值，為第0天值的10.921.95倍，跟第6天、第14天比較均有顯著差異P0.01；第14天回落至6.492.57倍，跟第6天相比差異沒(méi)統(tǒng)計(jì)意義P0.05。在一樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，除了第14天S組為最高外，其余時(shí)間點(diǎn)均為SF為最高P0.05附表。討論過(guò)去幾十年，最廣泛應(yīng)用的HS外表抗原標(biāo)志是D34。但隨著對(duì)HS研究的不斷深化，人們發(fā)現(xiàn)D34-細(xì)胞也具有自我更新和造血重建的才能1。1997年，兩個(gè)獨(dú)立的研究小組2,3分別報(bào)道了HS新的一種外表抗原標(biāo)志即A133。2022年召開(kāi)的第七屆人類白細(xì)胞分化抗原大會(huì)上A133正式命名為D133。D133不僅在HS中表達(dá)，而且在內(nèi)皮祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等早期階段的

9、細(xì)胞中亦有所表達(dá)6,7。D133+造血細(xì)胞能在胎羊模型中成功地實(shí)現(xiàn)了一次、二次移植2。D133+D34+細(xì)胞在ND/SID小鼠移植模型中，不僅可以重建髓系造血，還表現(xiàn)出T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表型8,9。臨床理論也說(shuō)明，D133+HS的移植是平安的、可行的10,11,12。目前許多研究者對(duì)HS擴(kuò)增的研究都是使用別離純化的D34+細(xì)胞或者D133+細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞分選之后進(jìn)展培養(yǎng)，雖然可以獲得較大的擴(kuò)增倍數(shù)，而且擴(kuò)增效果也較穩(wěn)定13，但D34+細(xì)胞能由D133+D34-細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生14，而D133+細(xì)胞也可能經(jīng)由D133-細(xì)胞產(chǎn)生15。因此分選細(xì)胞不可防止地造成D34+細(xì)胞或者D133

10、+細(xì)胞的喪失，同時(shí)也可能喪失比它們更加早期的造血細(xì)胞。而用于移植的臍血主要是以單個(gè)核細(xì)胞或全血的方式來(lái)儲(chǔ)存的，臍血造血干細(xì)胞移植的植入速度也主要和整個(gè)有核細(xì)胞數(shù)有關(guān)16。所以，本實(shí)驗(yàn)選用臍血N作為培養(yǎng)的起始細(xì)胞。我們的研究發(fā)現(xiàn)，單用SF+TP+FL細(xì)胞因子組合培養(yǎng)臍血N時(shí)，雖然D133+細(xì)胞能得到一定量的擴(kuò)增，但有核細(xì)胞總數(shù)都一直呈下降的趨勢(shì)。其原因可能是我們所用的細(xì)胞因子都是一些早期作用因子，在擴(kuò)增早期HS的同時(shí)，較晚期階段的造血細(xì)胞很快就衰老死亡。FU和D133+細(xì)胞檢測(cè)的數(shù)據(jù)也說(shuō)明，單用細(xì)胞因子也造成了早期HS的迅速耗竭。在單用基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中，有核細(xì)胞總數(shù)和D133+細(xì)胞都有一定的擴(kuò)

11、增，但增幅較校初期6天有核細(xì)胞總數(shù)有所下降，但同時(shí)期D133+細(xì)胞那么是有所擴(kuò)增。推測(cè)是因?yàn)镈133+早期造血細(xì)胞主要是處于G0/G1期17，細(xì)胞進(jìn)入增殖周期需要一定的時(shí)間，而這一時(shí)期的晚期階段造血細(xì)胞衰老死亡較快。經(jīng)過(guò)14天的培養(yǎng)后，單用基質(zhì)細(xì)胞組的FU計(jì)數(shù)一直上升為第0天值的17.463.42倍，表達(dá)出基質(zhì)細(xì)胞對(duì)延緩造血細(xì)胞的分化的重要作用。結(jié)合使用基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子時(shí)，有核細(xì)胞總數(shù)得到有效擴(kuò)增的同時(shí)，D133+細(xì)胞也得到了顯著的擴(kuò)增，比單用基質(zhì)細(xì)胞或者單用造血因子都有明顯的優(yōu)勢(shì)。在有核細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增方面，單用基質(zhì)細(xì)胞總的趨勢(shì)是擴(kuò)增，單用細(xì)胞因子時(shí)是一直在下降，結(jié)合使用基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子組合時(shí)，那么呈增加的趨勢(shì)，這說(shuō)明兩者合用具有協(xié)同促進(jìn)造血細(xì)胞增殖的效果。在進(jìn)展造血干細(xì)胞移植時(shí)，我們需要的不僅是能長(zhǎng)期造血的早期的造血干細(xì)胞，而且需要有助于短期內(nèi)迅速恢復(fù)造血的處于較晚期階段的造血祖細(xì)胞18。所以，基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞因子可能是比較接近臨床使用要求的擴(kuò)增臍血的方法。單份臍血的容量及所含的HS有限，不可以滿足體重較大的兒童和成人