定基因工程的概述

1、第一章 基因工程能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒光的第一節(jié) 基因工程的概述 又叫基因拼接技術或DNA重組技術。指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞，并使重組基因在受體細胞中表達，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術。一、 什么是基因工程 獲得人類所需的基因產(chǎn)物 結(jié) 果 剪切、拼接、導入、表達基本過程 DNA分子水平操作水平 基 因操作對象 生物體外操作環(huán)境基因拼接技術、DNA重組技術等 別 名二、轉(zhuǎn)基因操作的工具一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術刀”主要來源：種類與命名：作用特點：4.限制酶識別序列5.作用結(jié)果：識別特定核苷酸序列原核生物產(chǎn)生

2、黏性末端或平末端,切斷磷酸二酯鍵具有特異性。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成種類與命名： 現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRSma粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）大腸桿菌（Escherichia coli R）Go back練習：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:Hind、Hind和Hind磷酸二酯鍵限制酶識別DNA特定的序列,使D

3、NA分子鏈的固定部位分開。.Sma平末端平末端EcoR黏性末端黏性末端Go backEcoR黏性末端黏性末端Go back重復演示要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？ 會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?二、“分子縫合針” DNA連接酶作用: 把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成 可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，Ecoli DNA

4、連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶類型：類型EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別（二）“分子縫合針”DNA連接酶DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA聚合酶DNA連接酶化學本質(zhì)作用部位模板蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸二酯鍵（單個脫氧核苷酸+片段） 磷酸二酯鍵（DNA雙鏈片段 +DNA雙鏈片段）需要（DNA一條鏈）不需要“分子運輸車”質(zhì)粒質(zhì)粒：裸露、結(jié)構簡單、獨立于細菌染色體之外，具有自我復制

5、能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。3、運載體（運載工具）載基因進入受體細胞常用的運載體主要有兩類： 1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動植物病毒1、至少有一個（多個）限制酶切割位點，供外源DNA片段插入其中。2、重組運載體進入受體細胞后（或整合到染色體、DNA上），在受體細胞存在并進行自我復制。3，有特殊的遺傳標記基因，如抗四環(huán)素、氨芐青霉素等標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。（2）運載體的特點DNA重組技術的三件工具：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、運載體?？偨Y(jié)質(zhì)粒目的基因限制性內(nèi)切酶連接酶重組質(zhì)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因

6、的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術擴增（3）人工合成概念：基因文庫 （gene library）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫） 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library)（1）從基因文庫中獲取目的基因基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.基因組文庫與部分基因

7、文庫的關系 如果用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補DNA（也叫cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就構成了這種生物的cDNA文庫。這種方法稱反轉(zhuǎn)錄法cDNA文庫的構建（2）利用PCR技術擴增目的基因PCR聚合酶鏈式反應 是一項生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過此技術，可獲取大量的目的基因。PCR技術原理：前提：原料方式PCR擴增儀DNA復制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_方式擴增， 即_（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子 過程變性、退火、延伸三步曲變性：

8、加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸（3） 人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同種1.過程:二、基因表達載體的構建核心2、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？

9、為什么？3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導入受體細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。（一）轉(zhuǎn)化： 目的基因進入_內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持_和_的過程受體細胞穩(wěn)定表達（二）方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉

10、管通道法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉管通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因

11、），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物2.將目的基因?qū)雱游锛毎?）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎伎迹簽槭裁匆肅a2+處理受體細胞？用Ca2處理，增加細菌細胞膜的通透性四、目的基因的檢測與鑒定 分子水平檢測是否插入目的基因是

12、否轉(zhuǎn)錄是否翻譯 個體生物學水平檢測鑒定1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程: 將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針； 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測知識延伸DNA分子雜交技術 該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。（二）鑒定（個體生物學水平）2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mR

13、NA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:分 子 雜 交方法:抗原-抗體雜交過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內(nèi)是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達類型步驟檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測第一步目的基因是否進入受體細胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定 包

14、括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達和檢測對位訓練1.下列有關基因工程技術的敘述,正確的是（ ） A.重組DNA技術所用的工具酶是限制酶、連接酶 和載體 B.所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸 序列 C.選用細菌作為重組質(zhì)粒的受體細胞是因為細菌 繁殖快 D.只要目的基因進入受體細胞就能實現(xiàn)表達C2.利用外源基因在受體細胞中表達，可生產(chǎn)人類所 需要的產(chǎn)品。下列選項中能說明目的基因完成了 在受體細胞中表達的是（ ） A棉花二倍體細胞中檢測到細菌的抗蟲基因 B大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C

15、山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素DNA序列 D酵母菌細胞中提取到人干擾素蛋白D3、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物 溫度變化 恒溫A BC DD4、（多選）一個基因表達載體的構建應包括A目的基因 B啟動子 C終止子 D標記基因ABCD5、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是A啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼B啟動子和終止子都是特殊結(jié)構的DNA短片段，對mRN

16、A的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A6、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因 B.目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細胞 D.目的基因的檢測和表達C 例1 （08年全國卷理綜1）4.已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段。 現(xiàn)在多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該

17、酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是 A.3 B.4 C.9 D. 12 答案：C2(高考試題：2007全國理綜II)下列有關基因工程中限制內(nèi)切酶的描術，錯誤的是A.一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B.限制性內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C.限制性內(nèi)切酶能別和切割RNAD、限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取3、【生物現(xiàn)代生物技術專題】為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶

18、作用于 處。（填“a”或“b”）（2） 將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術。該技術的核心是 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢測，又要用 方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。基因槍法（花粉管通道法）植物組織培養(yǎng)去分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）41979年，科學家將動物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達成功。如右圖，請據(jù)圖回答問題。(1)此圖表示的是采取_ _方法獲取_基因的過程。人工（反轉(zhuǎn)錄）胰島素目的基因(2)圖中DNA是以_ _為模板，_形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的基因。胰島素mRNA逆轉(zhuǎn)錄 (3)圖中代表的是_酶，在它的作