傷寒Vi多糖疫苗

1、傷寒Vi多糖疫苗4.內(nèi)容：產(chǎn)品名稱及劑型產(chǎn)品名稱：傷寒Vi多糖疫苗產(chǎn)品劑型：液體劑型劑型產(chǎn)品概述：本品系用傷寒沙門(mén)菌培養(yǎng)液純化的Vi多糖，經(jīng)用PBS稀釋制成，不含 防腐劑。用于預(yù)防傷寒。生產(chǎn)工藝流程圖：菌種（Ty2 株 CMCC50098）!傳代（1代、2代）!小罐液體培養(yǎng)!大罐液體培養(yǎng)!殺菌、去菌體、收集多糖!純化!除菌過(guò)濾!原液檢定!稀釋!半成品檢定!分裝!成品檢定!包裝!成品生產(chǎn)、分包裝和檢定操作過(guò)程及工藝條件：菌種生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2010年版三部中“生物制品生產(chǎn)檢 定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。菌種名稱生產(chǎn)用菌種為傷寒沙門(mén)菌Ty2株CMCC50098。工作種子批的建

2、立工作種子批菌種來(lái)源于主種子庫(kù)菌種。主種子庫(kù)菌種經(jīng)開(kāi)啟，傳代擴(kuò)增后凍干， 凍干菌種經(jīng)檢定合格后為工作種子批。主種子庫(kù)菌種傳代主代凍干菌種啟開(kāi)后傳一代于肉湯瓊脂培養(yǎng)基，3537培養(yǎng)1620小時(shí)；傳 二代于肉湯瓊脂培養(yǎng)基，3537培養(yǎng)1620小時(shí)。工作種子批菌種的凍干制備生長(zhǎng)良好的二代菌種，混懸于脫脂牛奶保護(hù)劑中凍干。工作種子批菌種的檢定培養(yǎng)特性及染色鏡檢菌種接種于pH7.27.4的肉湯瓊脂培養(yǎng)基3537培養(yǎng)1620小時(shí)，應(yīng)為無(wú) 色半透明、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)的圓形菌落。染色鏡檢應(yīng)為革蘭陰性桿菌。生化特性接種葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖于3537培養(yǎng)57日，發(fā)酵葡萄 糖、麥芽糖、甘露醇（產(chǎn)

3、酸不產(chǎn)氣）；不發(fā)酵乳糖、蔗糖（現(xiàn)行版中華人民共 和國(guó)藥典三部中附錄XW）；氧化酶試驗(yàn)陰性。血清學(xué)特性（1）玻片凝集試驗(yàn)將在3537培養(yǎng)1620小時(shí)的活培養(yǎng)物與傷寒Vi及O 9、Hd參考血清做 玻片凝集試驗(yàn)，與Vi及Hd參考血清有強(qiáng)凝集反應(yīng)（+以上），與O 9參考 血清不產(chǎn)生凝集或僅有較弱凝集反應(yīng)。（2）定量凝集試驗(yàn)將在3537培養(yǎng)1620小時(shí)的活培養(yǎng)物，用PBS制成6.0X108/ml的菌懸液， 加入終濃度為0.5%甲醛溶液，殺菌后的菌液，與傷寒Vi參考血清作定量凝集試 驗(yàn)；另取經(jīng)10030分鐘加熱殺菌的菌液，與傷寒O參考血清作定量凝集試驗(yàn)。 充分搖勻后，放37過(guò)夜，以肉眼觀察結(jié)果，出現(xiàn)（+）

4、凝集之血清最高稀釋度 為凝集反應(yīng)效價(jià)。凝集效價(jià)應(yīng)不低于血清原效價(jià)之半。種子批的保存凍干后的主種子庫(kù)菌種和工作種子庫(kù)菌種保存于28。原液生產(chǎn)用種子工作種子批菌種啟開(kāi)后傳一代于肉湯瓊脂培養(yǎng)基，3537培養(yǎng)1620小時(shí)； 傳二代于肉湯瓊脂培養(yǎng)基，3537培養(yǎng)1620小時(shí)；傳三代于改良半綜合培 養(yǎng)基，培養(yǎng)35小時(shí)，濃度達(dá)3050億/ml時(shí)用于大罐培養(yǎng)。生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用改良半綜合培養(yǎng)基，不含有與十六烷基三甲基澳化銨能形成沉淀的成份，見(jiàn) 3.1。培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體通氣攪拌培養(yǎng)。溫度3537、通氣量50200L/min、pH6.8 7.4、培養(yǎng)68小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中及殺菌前取樣進(jìn)行菌液濃度測(cè)定及純菌試驗(yàn)，

5、涂片做革蘭染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則予以廢棄。收獲及殺菌當(dāng)菌液濃度達(dá)到200320億/ml時(shí)中止培養(yǎng)，取樣進(jìn)行菌液濃度測(cè)定及純菌檢 查。按培養(yǎng)量的1.2%加入甲醛溶液殺菌。純化去核酸去菌體采用連續(xù)流離心法將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清液。按終濃度0.06%0.10%加入十六烷基三甲基澳化銨，充分混勻，存放424小時(shí)，形成沉淀。采用連續(xù)流離心法收取沉淀物，并用0.5mol/L的氯化鈉溶液溶解沉淀物，攪 拌2小時(shí)，使多糖與十六烷基三甲基澳化銨解離。加入95%乙醇至最終濃度為25%，28靜置324小時(shí)，離心收集澄清的上 清液。沉淀多糖于上述上清液中加入95%乙醇至最終濃度為80%,充分振搖使多糖沉淀

6、，離心收 集沉淀。沉淀物用無(wú)水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后即為多糖粗制品。多糖粗 制品應(yīng)保存在一20以下。多糖純化將多糖粗制品溶解于1/10飽和乙酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)520mg/ml；按1:2 容量用冷酚（100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和乙酸鈉溶液）提取3次，離心 收集上清液，并用注射用水透析；加入乙醇至最終濃度為80%,離心收集的沉 淀物用無(wú)水乙醇洗2次，干燥后用滅菌注射用水溶解，即為精制多糖原液。原液檢定多糖原液取樣進(jìn)行。鑒別試驗(yàn)采用免疫雙擴(kuò)散法（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中附錄加I C）, Vi多 糖與傷寒Vi血清24小時(shí)內(nèi)應(yīng)形成明顯沉淀線，而與傷寒O血清不形成沉淀線。化學(xué)檢定

7、固體總量依法測(cè)定（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中附錄皿M）。蛋白質(zhì)含量不高于9mg/g （現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中附錄W B二法）。核酸含量不高于15mg/g,核酸在波長(zhǎng)260nm處的吸收系數(shù)任描）為200 （現(xiàn)行版中華 人民共和國(guó)藥典三部中附錄H A）。O一乙?；坎坏陀?mmol/g （現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中附錄W F）。多糖分子大小測(cè)定 多糖分子Kd值在0.25以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在50%以上（現(xiàn)行版中華人 民共和國(guó)藥典三部中附錄加I H）。無(wú)菌檢查依法檢查（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中附錄xn A）,符合規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查不高于40EU/ug苯酚殘余量不高于0.

8、1g/L。甲醛殘余量不高于0.2g/L。丙酮?dú)堄嗔坎桓哂?.0g/L。乙醇?xì)堄嗔坎桓哂?.0g/L。保存及有效期于一20以下保存，自多糖粗制品制造之日起有效期為60個(gè)月。半成品半成品配制半成品由單批或多批多糖原液合并，用無(wú)菌無(wú)熱原PBS （pH 7.2）稀釋。每1次人用劑量含多糖不低于30ug,不含防腐劑。PBS配方Na2HPO414.7g/萬(wàn) mlKH2PO44.3g/萬(wàn) mlNaCl68g/萬(wàn) mlPBS配制正確稱量NaCl、Na2HPO4和KH2PO4,在大立瓶中用適量注射用水溶解，濕熱滅菌。 稀釋配制用無(wú)菌無(wú)熱原PBS,將傷寒Vi多糖原液稀釋到每1次人用劑量含多糖不低于30 g,取樣送

9、檢。半成品檢定及貯存效期無(wú)菌檢查依法檢查（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部附錄xn A）,符合規(guī)定。半成品配制至分裝完成不超過(guò)72小時(shí)。成品分批應(yīng)符合現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中“生物制品分批規(guī)程”的有關(guān) 規(guī)定。分裝及凍干應(yīng)符合現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部中“生物制品分批規(guī)程”的有關(guān) 規(guī)定。規(guī)格每安甑5ml、1ml、0.5ml,每西林瓶0.5ml。每1次人用劑量0.5ml、含傷寒Vi多糖不低于30ug。包裝應(yīng)符合生物制品包裝規(guī)程的有關(guān)規(guī)定。包裝規(guī)格為10瓶/盒、1000瓶/箱。分裝后制品，經(jīng)質(zhì)量保證部檢定和綜合審評(píng)，對(duì)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)者發(fā)出包裝通知 單后，進(jìn)行包裝。制品在包裝前必須進(jìn)行外觀檢查。凡制

10、品顏色異常、有異物、封口不嚴(yán)、有黑 頭或裂紋等全部剔除。制品包裝標(biāo)簽及標(biāo)簽的內(nèi)容、格式符合中華人民共和國(guó)藥品管理法及國(guó)務(wù) 院藥品監(jiān)督管理部門(mén)的有關(guān)規(guī)定。包裝前，按質(zhì)量保證部發(fā)出的包裝通知單所載有效期準(zhǔn)備瓶簽，瓶簽上的字跡 清楚。包裝規(guī)格每安甑0.5ml, 5支/盒，1000支/箱。每安甑1.0ml, 5支/盒，1000支/箱。每西林瓶0.5ml, 1瓶/小盒，10瓶/中盒，200瓶/箱。每安甑5.0ml, 5支/盒，500支/箱。包裝制品在25以下進(jìn)行。每個(gè)最小包裝盒內(nèi)附有本制品的使用說(shuō)明書(shū)。成品檢定 除裝量差異、水分測(cè)定、多糖含量、多糖分子大小測(cè)定和異常毒性檢查外，按制 品標(biāo)示量加入滅菌PB

11、S復(fù)溶后進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定。鑒別試驗(yàn)按。外觀為無(wú)色透明液體，無(wú)異物?；瘜W(xué)檢定pH值6.57.5 （現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部附錄V A）。多糖含量每人用劑量多糖含量應(yīng)不低于30 口 g。稱取0.6g瓊脂糖，加入0.05mol/L巴比 妥緩沖液（pH8.6） 40ml中，加熱溶脹完全，待冷卻至約56時(shí)，加入傷寒Vi 血清1ml,混勻后迅速傾倒于10cmX9cm的潔凈水平玻板上，待凝膠凝固后用直 徑3mm的打孔器在距底邊1.5cm處打孔。各孔中分別加入各稀釋好的傷寒Vi抗 原標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度分別為：100ug/ml, 50 Hg/ml, 25 u g/ml, 12.5 Hg/ml, 6.25ug/

12、ml）和本品5口1 （本品做雙孔）?？拷吘壱豢字锌杉尤?0口1澳酚藍(lán) 指示液。加樣后將玻板置于電泳槽上，濾紙搭橋，加樣端與電泳儀負(fù)極相連。采 用0.05mol/L巴比妥緩沖液（pH8.6）為電極緩沖液，8V/cm恒壓電泳至指示劑 遷移到前沿。取下玻板浸泡于0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液12小時(shí)后，覆蓋潔凈濾紙 移至培養(yǎng)箱中過(guò)夜烤干。用考馬斯亮蘭染色液染色至火箭峰出現(xiàn)，用甲醇一乙酸 脫色液脫色至背景清晰。準(zhǔn)確測(cè)量火箭峰高，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)和相應(yīng)的峰高 作直線回歸，得直線回歸方程，將供試品的峰高均值代入直線回歸方程，求出供 試品濃度。無(wú)菌檢查依法檢查（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部附錄XD A）,符合規(guī)定。 異常毒性檢查依法檢查（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部附錄XX F）,符合規(guī)定。 熱原檢查依法檢查（現(xiàn)行版中華人民共和國(guó)藥典三部附錄XX D）,注射劑量家兔體重 每1kg注射0.025ug多糖。4.4.5保存、運(yùn)輸及有效期于28避光保存和運(yùn)輸，自生產(chǎn)之日起有效期為24個(gè)月。4.5質(zhì)量監(jiān)控：菌種菌種檢定按本規(guī)程，檢定合格的菌種方可用于生產(chǎn)。生產(chǎn)菌種三代菌種采集后取樣做純菌試驗(yàn)，濃度檢測(cè)、測(cè)pH值，染色鏡檢，按投料批次， 每批次檢測(cè)一次。大罐培養(yǎng)濃度檢測(cè)、測(cè)pH值，染色鏡檢，開(kāi)始培養(yǎng)23小時(shí)后，每小時(shí)監(jiān)測(cè)一次作濃