EASYSPIN 細(xì)菌RNA快速提取提取試劑盒(原平皓)課件

1、EASYSPIN 細(xì)菌RNA快速提取提取試劑盒2010.06.17主要內(nèi)容二、EASYSPIN細(xì)菌RNA提取 一、一般RNA提取的注意事項(xiàng) 三、DNAse I柱上消化一、一般RNA提取的注意事項(xiàng) RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。 常用的RNA酶抑制劑 焦碳酸二乙酯（DEPC） 異硫氰酸胍 氧釩核糖核苷復(fù)合物 RNA酶蛋白抑制劑離心柱法RNA提取中經(jīng)常遇到的問題：1、RNA降解或提取不到；2、基因組DNA污染；3、蛋白污染。RNA降解一般解決方法：1、操作人員戴手套，操作期間盡量不講話；2、實(shí)驗(yàn)所用的移液器槍頭、離心管、

2、研缽、70%乙醇等用DEPC處理；3、盡快讓樣品與裂解液充分接觸；4、對(duì)于多糖多酚類植物，需要加入PLANTAID去除多糖多酚?；蚪MDNA污染一般解決方法：1、減少樣品處理起始量；2、增加去蛋白液作用時(shí)間；3、DNAse I處理。蛋白污染一般解決方法： 1、增加去蛋白液作用時(shí)間；2、獲得RNA溶液后離心去除不溶性蛋白。二、EASYSPIN細(xì)菌RNA快速提 取試劑盒原理：獨(dú)特的裂解液/-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的

3、RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。產(chǎn)品特點(diǎn)：吸附量差異極小，可重復(fù)性好。不需要使用有毒的苯酚,氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟?？焖?，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.92.0，基本無DNA殘留。儲(chǔ)存事項(xiàng)：裂解液、去蛋白液低溫析出，37加熱重新溶解即可。溶菌酶為粉狀物，收到后按照說明配制成工作液，分裝冷凍，避免多次凍融。所有瓶蓋應(yīng)擰緊，避免揮發(fā)。注意事項(xiàng)需要自備乙醇， -巰基乙醇；漂洗液要加入指定量無水乙醇；所有離心步驟均在室溫進(jìn)行。操作步驟：離心收集1-2ml菌液(108-109細(xì)胞)到一個(gè)1.5m

4、l離心管, 盡可能去除上清。加入TE重懸，100l(5x108細(xì)胞)/ 200l(5x108-7.5x108細(xì)胞) ，加入適量破壁酶，孵育適當(dāng)時(shí)間破壁。加入RLT(350/700l），劇烈振蕩20s。 加入250/500l無水乙醇，混勻。上柱、漂洗、洗脫。一、反應(yīng)液的配制以Qiagen RNase free DNase set 舉例（qiagen貨號(hào)：79254）A:DNase I 儲(chǔ)存液的配制： 將DNase I 干粉（1500 Kunitz 單位）溶解在550l RNase-free 水中，輕柔混勻，分裝后-20貯存（可保存9 個(gè)月）。注意從-20融化后的DNase I 儲(chǔ)存液保存于4（可保存6 周），不要再次凍存。B: DNase I 工作液的配制： 取10l DNase I 儲(chǔ)存液加70l RDD(產(chǎn)品中附帶)溶液，輕柔混勻。二、操作步驟1前面按照正常步驟操作，在加入去蛋白液RW1步驟前按照以下步驟操作。2向吸附柱RA 中加入350 l 去蛋白液RW1，12,000 rpm 離心30-60 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。3向吸附柱RA 中央加入80l 的DNase I 工作液，室溫放置15 分鐘。4 向吸附柱RA 中加入350 l 去蛋白液RW1， 12,000