超高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)技術(shù)

1、GE超高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)利用活細(xì)胞成像工作站進(jìn)行細(xì)胞和基因的功能研究，是生物醫(yī)學(xué)研究的最新趨勢。固定細(xì)胞觀 察僅能提供固定瞬間細(xì)胞的靜態(tài)信息，無法反映細(xì)胞在正常生理生化條件下的狀態(tài)?；罴?xì)胞觀 察，對處于正常生理狀況下的細(xì)胞進(jìn)行全程掃描和記錄，獲得其連續(xù)、全面、動(dòng)態(tài)過程由于其 顯示的正常細(xì)胞動(dòng)態(tài)的活動(dòng)過程，很容易發(fā)現(xiàn)和確定細(xì)胞間相互作用和信號傳導(dǎo)的過程，以及 在活細(xì)胞水平上的生物分子間的相互作用，不僅可以解決長期以來懸而未解的問題，更為未來 的研究提出新的問題，指出新的方向。一、活細(xì)胞成像系統(tǒng)原理目前主流的活細(xì)胞成像系統(tǒng)從原理上可以分為兩大類： 基于寬場反卷積技術(shù)基于共聚焦技術(shù)兩種技術(shù)作為目前

2、最流行的活細(xì)胞成像技術(shù)，均可以實(shí)現(xiàn)在維持細(xì)胞存活的情況下，快速獲取 單一焦平面的信號，在具體性能上則各有擅長。寬場反卷積技術(shù)對光線進(jìn)行反卷積運(yùn)算是光學(xué)成像領(lǐng)域的成熟技術(shù)，最早由美國國家航空航天局開發(fā)并成為觀 察微弱天體信號的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。去卷積和共聚焦技術(shù)是光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域獲得單一焦平面光線的兩 大主流技術(shù)(J.M.Murray, live cell imaging, 2010)。通過將非焦平面的光線還原至焦平面 上，大大提高了樣品信號的強(qiáng)度以及圖像的信噪比。由于去卷積技術(shù)設(shè)計(jì)到大量的后期運(yùn)算， 因此在高性能計(jì)算機(jī)發(fā)明以前，一直受制于運(yùn)算能力，沒有得到大規(guī)模的推廣。隨著近年來計(jì) 算機(jī)性能的大幅提升和

3、價(jià)格的下降，去卷積技術(shù)逐漸成為光學(xué)顯微鏡的主流技術(shù)。一個(gè)點(diǎn)光源 經(jīng)過顯微鏡的光路，由于鏡片對光線的衍射和散射，最終呈現(xiàn)在觀察者面前的是一個(gè)模糊的點(diǎn)， 所以點(diǎn)光源變成模糊的點(diǎn)的過程即為卷積。反卷積就是把模糊的點(diǎn)還原成點(diǎn)光源的過程。以API公司的DeltaVision系統(tǒng)為例，其反卷積過程經(jīng)歷以下幾步：首先通過無數(shù)的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)，得到點(diǎn)光源經(jīng)過顯微鏡物鏡后變模糊的規(guī)律，建立模型。選擇完美的物鏡，保證樣品信號經(jīng)過物鏡后變模糊的規(guī)律符合步驟一中得到的模型。將通過顯微鏡光路的所有的光信號進(jìn)行收集，因?yàn)辄c(diǎn)光源經(jīng)過顯微鏡光路后會變成一個(gè)空 間中的倒圓錐形，所以在收集信號的時(shí)候需要很準(zhǔn)確的記錄信號的2軸信息。對

4、收集到的所有光信號按照步驟一中的模型進(jìn)行還原，最終將模糊的點(diǎn)還原成清晰的點(diǎn)， 客觀反映它在空間的位置和強(qiáng)度。目前去卷積技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)圖像的研究中。共聚焦技術(shù)共聚焦顯微鏡它采用點(diǎn)光源(point lightsource)照射標(biāo)本，在焦平面上形成了一個(gè)輪廓分明 的小的光點(diǎn)(light spot )，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到探測 器。探測器前方有一個(gè)針孔(pinhole)，幾何尺寸可調(diào)。這樣，來自焦平面的光,可以會聚在探 測針孔范圍之內(nèi)，而其它來自焦平面上方或下方的散射光，都被擋在探測針孔之外而不能成象。 光束掃描器又分為單光束、多光束或狹縫掃描器幾種。其

5、中單光束掃描獲得的圖像質(zhì)量最好 狹縫掃描器雖然產(chǎn)生圖像的速率很高(可達(dá)實(shí)時(shí)水平)，但其圖像信噪比低于單光束掃描，這是 因?yàn)閺莫M縫長軸來的漫射光不能被有效遮擋。多光束掃描如碟片式共聚焦是由電動(dòng)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)Nipkow盤旋轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)的，其熒光量較低，速率一般較高。寬場反卷積技術(shù)與共聚焦技術(shù)比較表成像技術(shù)寬場去卷積單點(diǎn)掃描共聚焦多點(diǎn)掃描共聚焦靈敏度（相對）100520速度25-30幀/秒（512X512 像素）5幀/秒（512X512 像素）25-30幀/秒（512X512 像素）激發(fā)光強(qiáng)度揭強(qiáng)較強(qiáng)光淬滅弱強(qiáng)較強(qiáng)信噪比高低低樣品厚度小于30微米小于70微米小于70微米二、API高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)的主要特

6、點(diǎn)DeltaVision活細(xì)胞成像系統(tǒng)有以下優(yōu)勢：1）高靈敏：得益于精密和高效的光路，以及領(lǐng)先的還原型反卷積技術(shù)，DeltaVision將寬場 顯微鏡的靈敏度和分辨率提高到新的水平，標(biāo)準(zhǔn)配置下最低可以探測到13個(gè)GFP分子，成 為目前為止最靈敏的光學(xué)顯微系統(tǒng)之一。HIV病毒通過DC細(xì)胞和T細(xì)胞的接觸侵染T細(xì)胞，綠色顆粒為HIV病毒2）高速：標(biāo)配下可達(dá)到21幀/秒（512X512）的成像速度。當(dāng)配備EM-CCD后，最高可達(dá)到 224幀/秒（64X64），可用于囊泡運(yùn)動(dòng)和鈣火花等快速的生理生化過程觀察。3)4)低光毒性：得益于靈敏度的顯著提高，即使微弱的熒光，也可以收集到足夠的信號，因此 激發(fā)光的

7、強(qiáng)度和時(shí)間可以大幅度減少。光損傷和光淬滅不再是活細(xì)胞和微弱熒光觀察的障 礙。3)4)智能：焦點(diǎn)漂移和細(xì)胞脫離視野是活細(xì)胞觀察的夢魘。DeltaVision特有的自動(dòng)對焦（autofocus）和細(xì)胞跟蹤（cell tracking）功能，不僅可以自動(dòng)維持焦平面的穩(wěn)定，而通過對熒光信號和細(xì)胞輪廓的識別，DeltaVision可以精確的 跟蹤需要觀察的細(xì)胞。通過對熒光信號和細(xì)胞輪廓的識別，DeltaVision可以精確的 跟蹤需要觀察的細(xì)胞。5)免維護(hù)：整個(gè)系統(tǒng)無易損易耗部件，光源壽命在5000小時(shí)以上，可正常使用7-10年以上， 無需更換光源和校準(zhǔn)光路。系統(tǒng)控制和圖形處理基于Linux操作系統(tǒng)，更

8、適合多線程控 制和數(shù)據(jù)處理，不僅大幅度降低了數(shù)據(jù)處理時(shí)間，也避免了在數(shù)據(jù)傳輸過程中感染病毒的 危險(xiǎn)。人性化的softWoRX軟件簡單易用，一個(gè)對話框內(nèi)即可完成所有的控制操作。5)三、API高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)的主要功能與應(yīng)用領(lǐng)域1）多維成像目前可以做到六維（XYZ三維，時(shí)間，不同點(diǎn)，不同波長）成像。通過光學(xué)切片（optical section）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對樣品的3D觀察，構(gòu)建樣品的立體結(jié)構(gòu)。經(jīng)過3D經(jīng)過3D重建的腫瘤細(xì)胞：A為正面，B為旋轉(zhuǎn)30度后，C為旋轉(zhuǎn)90度后。3D還原型反卷積處理顯微鏡的分辨率和圖像的對比度取決于物鏡收集的光學(xué)信息。顯微鏡光路中衍射和折射現(xiàn)象的 存在，使得樣品信號的位置

9、和強(qiáng)度都發(fā)生了變化，降低了系統(tǒng)的分辨率和圖像的質(zhì)量。API作 為對圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積處理最早的實(shí)踐者，將顯微鏡的硬件設(shè)計(jì)和后期軟件處理完美的結(jié)合 在一起，通過對光學(xué)信號的3D還原型反卷積處理，大大提高了顯微鏡的靈敏度和分辨率。oQE880n_u.oQE880n_u.Position (pixels)原始圖像和經(jīng)過3D反卷積處理后圖像的對比：A, B為處理前，C,D為處理后。經(jīng)過反卷積處理后，信號的強(qiáng)度和圖像對比度得到很大提升。延時(shí)攝影通過軟件精確的控制，拍攝的時(shí)間間隔從數(shù)秒到數(shù)小時(shí)不等，在長時(shí)間拍攝下也不會造成熒光 信號的淬滅。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求的不同，無論單一層面還是3維結(jié)構(gòu)，都可以獲得良好的效果

10、。正在分裂的Hela細(xì)胞，其中綠色標(biāo)記微管蛋白，紅色標(biāo)記染色體4）高速離子成像結(jié)合高速CCD和高效的光路，在512X512像素下仍然可以實(shí)現(xiàn)21幀/秒的成像速度。對于快 速的離子濃度的變化，最快可以50-100幀/秒的速度獲取圖像。Sodium Ortho vanadate細(xì)胞間鈣信號的傳遞。使用Fluo-3細(xì)胞間鈣信號的傳遞。使用Fluo-3標(biāo)記胞內(nèi)的鈣離子，并給予熒光信號對鈣離子的強(qiáng)度進(jìn)行成像M-旦 M 絲整-8=gson_L_5.熒光共定位分析通過比較多個(gè)熒光通道的定位情況，即可知道他們在空間上和時(shí)間上的分布信息，進(jìn)而得到相 應(yīng)的熒光信號是否存在相互作用、協(xié)同運(yùn)動(dòng)、定向運(yùn)輸?shù)取ｓw外重組的

11、病毒顆粒侵染細(xì)胞， 綠色標(biāo)記病毒的殼蛋白，紅色標(biāo) 記病毒的RNA結(jié)合蛋白。病毒入 侵前，由于病毒顆粒完整，綠色 信號和紅色信號共定位。病毒入 侵細(xì)胞后，脫掉表面的殼蛋白，綠色信號和紅色信號分離。體外重組的病毒顆粒侵染細(xì)胞， 綠色標(biāo)記病毒的殼蛋白，紅色標(biāo) 記病毒的RNA結(jié)合蛋白。病毒入 侵前，由于病毒顆粒完整，綠色 信號和紅色信號共定位。病毒入 侵細(xì)胞后，脫掉表面的殼蛋白，綠色信號和紅色信號分離。6）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）DeltaVision特制的活細(xì)胞濾片組保證CFP/YFP, GFP/mcherry （RFP）熒光強(qiáng)度的精確記錄，并 進(jìn)一步計(jì)算出蛋白對之間精確的能量轉(zhuǎn)移系數(shù)。Donor control crosstalk = 0959Acceptor control crosstalk =0.2357Donor control crosstalk = 0959Acceptor control crosstalk =0.2357Coefficient ACoefficient ACoefficierit B=332.41/259.48 = 1.28= 513.52/460.18 = 1.12計(jì)