分子發(fā)光熒光磷光以及化學發(fā)光

1、關于分子發(fā)光熒光磷光及化學發(fā)光1第1頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四3.光分析方法光分析法原子吸收法紅外法原子發(fā)射法核磁法熒光磷光化學發(fā)光紫外可見法分子光譜原子光譜2第2頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第六章 分子發(fā)光熒光、 磷光及化學發(fā)光Chapter SixFluorescence Phosphorescence and Chemiluminescence3第3頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子發(fā)光 熒光、磷光及化學發(fā)光 Fluorescence Phosphorescence and chemilumi

2、nescence6.1 分子發(fā)光的基本原理6.2 分子熒光和磷光的影響因素6.3 熒光（磷光）分光光度計6.熒光分析法的應用6.化學發(fā)光分析法4第4頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內科醫(yī)生和植物學家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“Lignum Nephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光光度計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，

3、從而導入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術語。1867年，Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，應用鋁桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計。6.1 分子發(fā)光的基本原理5第5頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四 分子光譜的產(chǎn)生1分子的能級210012 ,0 ,1 ,21J023J0231J0231J0231分子紫外吸收光譜分子可見吸收光譜分子紅外吸收光譜分子光譜：連續(xù)光譜 帶光譜遠紅外光譜中紅外光譜紫外-可見光譜6第6頁，共

4、105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉移紫外可見共振熒光光譜內轉移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫. 無輻射躍遷的類型振動弛豫: Vr 10-12sec外 轉 移:無輻射躍遷回到基態(tài)內 轉 移:S2S1能級之間有重疊系間竄躍: S2T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后 T1 S2. 輻射躍遷的類型共振熒光：10-12 sec熒 光：10-8 sec磷 光：1010-4 sec遲滯熒光:10210-4 sec7第7頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四. 單重態(tài)與三重態(tài)受激有機分子的電

5、子激發(fā)態(tài)可以歸納為兩種狀態(tài)：基態(tài)激發(fā)態(tài)單重態(tài)激發(fā)態(tài)三重態(tài)激發(fā)態(tài)平均壽命 10-8sec激發(fā)態(tài)平均壽命10-41 secS0S0S0S1T18第8頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四9第9頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉移紫外可見共振熒光光譜內轉移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫. 無輻射躍遷的類型振動弛豫: Vr 10-12sec外 轉 移:無輻射躍遷回到基態(tài)內 轉 移:S2S1能級之間有重疊系間竄躍: S2T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后 T1 S2. 輻射躍遷的

6、類型共振熒光：10-12 sec熒 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec遲滯熒光:10210-4 sec10第10頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四振動弛豫 當分子吸收光輻射后可能從基態(tài)的最低振動能層躍遷到激發(fā)態(tài)的較高的振動能層上去然而，在液相或壓力足夠高的氣相中分子間碰撞的幾率很大，激發(fā)態(tài)分子可能將過剩的振動能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，而自身從高振動能層失活到該電子能級的最低振動能層上，這一過程稱為振動弛豫發(fā)生振動弛豫的時間為10-12s數(shù)量級11第11頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四內轉換 內轉換指的是相同多重度等能態(tài)間的

7、一種無輻射躍遷過程當兩個電子能級的振動能層間有重疊時，則可能發(fā)生電子由高能層以無輻射躍遷方式躍遷到低能層的電子的激發(fā)態(tài)內轉換過程在10-1310-11s時間內發(fā)生，它通常要比由高激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度快得多 12第12頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四外轉換 激發(fā)分子通過與溶劑或其他溶質間的相互作用和能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程稱外轉換這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”自較低的激發(fā)單重態(tài)及較低的三重態(tài)的非輻射躍遷可包含外轉換，也可包含內轉換13第13頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四系間跨躍系間跨越指的是不同多重度狀態(tài)間的一種無

8、輻射躍遷過程它涉及受激電子自旋狀態(tài)的改變如S1到T1，使原來兩個自旋配對的電子不再配對這種躍遷是禁阻的，但如果兩個電子能態(tài)的振動能層有較大的重疊時，如圖中激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能層與激發(fā)三重態(tài)T1的較高振動能層重疊，則可能通過自旋軌道耦合等作用使S1態(tài)轉入 T1態(tài)的某一振動能層 14第14頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四熒光、磷光發(fā)射從單重態(tài)到三重態(tài)的分子系間跨越躍遷發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動弛 豫而到達三重態(tài)的最低振動能層上，當沒有其他過程同它競爭時，在10-410s左右時間內 躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光由此可見，熒光與磷光的根本區(qū)別是：熒光是由第一電子激發(fā)單重態(tài)最低

9、振動 能層至基態(tài)各振動能層的躍遷產(chǎn)生的，而磷光是由第一電子激發(fā)三重態(tài)的最低振動能層至基態(tài)各振動能層間躍遷產(chǎn)生的 15第15頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四16第16頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四17第17頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四1. 分子熒光與磷光的產(chǎn)生（1） 單重態(tài)與三重態(tài)（2） 分子的活化與去活化（3） 分子發(fā)光的類型按激發(fā)的模式分類： 按分子激發(fā)態(tài)的類型分類： 光致發(fā)光化學發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光摩擦發(fā)光 分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光瞬時熒光遲滯熒光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)

10、： ex em共振熒光(Resonance)： ex = em 熒光 18第18頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四2. 分子熒光(磷光)光譜(1) 熒光(磷光)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)均為光致發(fā)光，在光輻射的作用下，熒光物質發(fā)射出不同波長的熒光。a. 激發(fā)光譜固定em= 620nm(Max)ex = 290nm (Max)固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似19第19頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四ex =290nm (MAX)固定em= 620nm(Max)固定ex= 290nm (Max)em= 620nm

11、(MAX)b. 發(fā)射光譜 (熒光光譜)固定激發(fā)波長 掃描發(fā)射波長c. 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過極快的內轉換和振動弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動、轉動能級，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。1 41 31 2111 11 21 31 420第20頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四d. 磷光光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜21第21頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四22第22

12、頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四23第23頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（2）三維熒光光譜I F f (ex 、em)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長24第24頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四I F f (ex 、em)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長25第25頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四蒽的三維等高線光譜圖 26第26頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四蒽的三維等熒光強度光譜27第27頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星

13、期四VB1和VB2的三維熒光光譜28第28頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜（3）三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線光譜圖共振光散射瑞利散射固定ex= 270nm拉曼光二級共振光散射三級共振光散射熒光光譜有用區(qū)間29第29頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四3. 分子熒光(磷光)強度與熒光物質濃度的關系（1）熒光強度(磷光)與濃度的關系光吸收定律（Lambert Beer Law）相應的吸光分數(shù)為：熒光強度（IF）與相應的吸光分數(shù)成正比：按照級數(shù)展開式：30第

14、30頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四對于稀溶液，當 bc0.05（磷光 bc1000F (s)2.62.51.40.230.0140.0023（6）溶劑效應藍移: E n * E n * 紅移: E* E* 在極性溶劑中：無溶劑化作用有溶劑化作用39第39頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四 金屬螯合物的熒光（1） 螯合物中配位體的發(fā)光（2） 螯合物中金屬離子的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強熒光2,2-二羥基偶氮苯無熒光2,2-二羥基偶氮苯-Al螯合物強熒光T1系間竄躍S0S1d *、f* d * d f* f 熒光分

15、子內能量轉移40第40頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四熒光的熄滅（1） 碰撞熄滅熒 光 熄 滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質分子相互作用引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：這些溶劑分子或其它溶質分子稱為熒光熄滅劑。相對速率 1K1 M*K2 M* Q與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關。（2） 能量轉移熄滅再吸收過程：共振能量轉移：分子內能量轉移：hv激發(fā)發(fā)射熄滅41第41頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（3） 氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑（4） 自熄滅與自吸收當熒光物質的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自

16、吸收：沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光由于F 5s。還有一種慢發(fā)光，化學發(fā)光強度在一段時間基本保持不變，然后再較快的上升或下降。75第75頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四化學發(fā)光的動力學曲線76第76頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四設某分析物與過量試劑作用而發(fā)光，則此時的化學發(fā)光強度與分析物濃度有如下關系 式中，ICL(t)為在時刻t的化學發(fā)光強度，以每秒產(chǎn)生的光量子數(shù)表示，為化學發(fā)光效率，-dc/dt為分析物參加反應的速度，即每秒?yún)⒓臃磻姆肿訑?shù)。(2)77第77頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四為了提高測量的靈

17、敏度，也可采用測量峰面積，即在一定時間間隔內對化學發(fā)光強度進行積分，得到發(fā)光強度的積分值：(3)78第78頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四此時，t1和t2若為反應過程中的某一段時間間隔，則積分值只是部分化學發(fā)光強度的積分值。如果t1取零，t2取反應結束所需時間，得到的就是整個反應產(chǎn)生的總發(fā)光強度。它相當于化學發(fā)光動力學曲線下的整個峰面積，它與分析物濃度存在線性關系。這種分析方法實質上是一種平衡法，特別適于慢的化學發(fā)光。79第79頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四當然，化學發(fā)光反應對指定的測定最好是專屬的（如酶法化學發(fā)光），這樣就勿需實行光學

18、分辨或化學方法排除干擾許多化學發(fā)光的強度與分析物質的濃度在幾個數(shù)量級之內呈良好的線性關系 80第80頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四化學發(fā)光反應的類型（1） 直接化學發(fā)光和間接化學發(fā)光直接化學發(fā)光是被測物作為反應物直接參加化學發(fā)光反應，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。表示如下：A + B C* + D C* C + hv式中A或B是被測物，通過反應生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*。當C*躍回激態(tài)時，輻射出光子。81第81頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四間接化學發(fā)光是被測物A或B通過化學反應后生成初始激發(fā)態(tài)C*，C*不直接發(fā)光，而是將

19、其能量轉移給F，使F處于激發(fā)態(tài)，當F*躍回基態(tài)時，產(chǎn)生發(fā)光如下式表示：A + B C* + D C* + F F* +E F* F + hv式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。例如，用羅丹明B沒食子酸的乙醇溶液測定大氣中的O3，其化學發(fā)光反應就屬這一類型。82第82頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四沒食子酸 + O3 A* + O2A* + 羅丹明B 羅丹明B* + B羅丹明B* 羅丹明B + hv沒食子酸被O3氧化時吸收反應所產(chǎn)生的化學能，形成受激中間體A*，而A*又迅速將能量轉給羅丹明B，并使羅丹明B分子激發(fā)，處于激發(fā)態(tài)的羅丹明B分子回到基態(tài)時，發(fā)射光子，該光

20、輻射的最大發(fā)射波長為584nm。83第83頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四氣相化學發(fā)光主要有O3、NO、S的化學發(fā)光反應，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。NO與O3的氣相化學發(fā)光反應有較高的化學發(fā)光效率，其反應機理為NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + hv（2） 氣相化學發(fā)光和液相化學發(fā)光84第84頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四這個反應的發(fā)射光譜范圍為666875nm，靈敏度可達1ng/ml。也可同時測定大氣中NO2的含量，將NO2還原為NO，測定二者的總量，再減去NO的量。液相化學發(fā)

21、光的幾種體系：魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯85第85頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（3）異相化學發(fā)光和生物化學發(fā)光異相化學發(fā)光 如在含有羅丹明B和沒食子酸的硅膠上，O3與沒食子酸反應生成高能中間體A*，然后將能量轉移給羅丹明B接受體而發(fā)光。該反應用于氣球探測器或氣相衛(wèi)星上，以便測定大氣或同溫層的O3含量。86第86頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四生物化學發(fā)光 熒火蟲素與三磷酸腺苷（ATP）反應，在螢火蟲素酶（E）與Mg2+存在時生成螢火蟲素與一磷酸腺苷（AMP）的復合物和焦磷酸鎂，然后復合物與氧發(fā)生化學發(fā)光反應，CL接近于1。 該體系可

22、測定210-17molL-1的ATP，這相當于一個細菌的ATP含量，靈敏度很高，選擇性很好。87第87頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四魯米諾化學發(fā)光反應的機理在常用的化學發(fā)光分析的發(fā)光物質中，魯米諾的應用最廣泛。深入的研究已經(jīng)給出魯米諾化學發(fā)光反應機理的初步模式。它產(chǎn)生化學發(fā)光反應的CE為0.010.05。88第88頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四魯米諾氧化發(fā)光原理 hv(max=425nm） 3-氨基苯二甲酰環(huán)肼89第89頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四魯米諾（3-氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中可被一些氧化劑

23、氧化，產(chǎn)生最大發(fā)射波長為425nm的化學發(fā)光。發(fā)光過程有兩種方式，即單電子氧化和雙電子氧化，單電子氧化得到中間體魯米諾游離基；雙電子氧化得到中間體疊氮醌，而最后發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根陰離子。在堿性溶液中，I2與魯米諾的化學發(fā)光反應屬于雙電子氧化過程，該化學發(fā)光體系可檢測碘的濃度低達510-10molL-1。90第90頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四金屬離子催化魯米諾-H2O2體系的化學發(fā)光反應大都屬于單電子氧化過程。例如： Mn+ + HO2-Mn+HO2- Mn+HO2-+魯米諾H2OM(n+1)+魯米諾游離基3OH- 魯米諾游離基+HO2-化學發(fā)光上述歷程

24、中Mn+（如Co2+）參與了反應，價態(tài)升高，本身是還原劑。91第91頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四液相化學發(fā)光的測量儀器大多數(shù)化學發(fā)光和生物發(fā)光測量儀器稱為光度計，因為這類儀器只有光電檢測，沒有單色器提供光色散。也有人稱這類儀器為發(fā)光光度計。商品名稱則更為多種多樣。液相化學發(fā)光的一個重要優(yōu)點是儀器比較簡單，一般僅有進樣系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)組成 。92第92頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四化學發(fā)光儀示意圖93第93頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（1） 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)包括化學發(fā)光反應池、試樣注射器、聚光和控溫裝置等

25、。保證試樣能在反應池內均勻混合，產(chǎn)生的光輻射供檢測系統(tǒng)檢測。進樣分靜態(tài)注射和流動注射兩種方式。試樣反應池反應池的材料可根據(jù)不同要求選擇玻璃、石英或塑料等，池的形狀要與光電管的有效接受面積相匹配。若為流動分析則形狀、大小都有嚴格要求。94第94頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四進樣器在靜態(tài)注射進樣方式中，進樣器通常為微量吸量管或各種形式的注射器，容積從微升到毫升不等。若為流動注射進樣方式，用泵代替注射器或加有注射閥。95第95頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四聚光裝置為了提高檢測效率，通常在試樣池的后方裝一聚光裝置。這種裝置可以是凹面鏡，簡單的

26、也可用一平面鏡，也可直接在池子外面半圓圈周上鍍一個鏡面，使化學反應的光輻射能有效地到達光電管接受面。好的聚光裝置可使進入檢測器的光達50%。96第96頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四進樣方式在靜態(tài)注射進樣方式中，可以是反應物混合后最后注入分析物，也可以是分析物與介質混合后再注入反應物。應根據(jù)分析要求和反應體系特點，選擇最佳進樣程序。靜態(tài)進樣的優(yōu)點在于反應條件容易選擇且使用方便，儀器價格也較低廉。97第97頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四（2） 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)包括光電轉換、信號放大、信號處理和數(shù)據(jù)顯示等部分。光信號轉換為電信號由光電倍增管來完成。對于某一特殊用途的儀器，僅要求檢測器的光譜響應最大值與指定應用體系的化學發(fā)光光譜峰值相同或相近即可；對通用儀器，則管子光陰極的光譜響應范圍越寬越好，以適應各種不同的發(fā)光體系。98第98頁，共105頁，2022年，5月20日，14點24分，星期四影響液相化學發(fā)光強度的主要因素 （1）溶液酸度不同的化學發(fā)光體系要求在不同的pH值下進行才能獲得最大的發(fā)光強度。試液的酸度會影響發(fā)光活性物質的有效濃度，對化學光強度直接產(chǎn)生影響，所以反應液及試液的酸度對化學發(fā)光強度影響很大。每個發(fā)光體系的最