酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件

1、第四節(jié) 酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：藥物含量（活性）測(cè)定宿主蛋白殘留檢測(cè)抗生素殘留檢測(cè)雜質(zhì)檢測(cè)污染物檢測(cè)藥物原材料檢測(cè)藥物摻假檢測(cè)第四節(jié) 酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用其應(yīng)用主要包括以一、GLP-1活性檢測(cè)Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) ELISA Kit 一、GLP-1活性檢測(cè)Cyclic Adenosine MoGLP-1 GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強(qiáng)的腸肽類激素，它通過(guò)與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合發(fā)揮作用 1）GLP-1可通過(guò)刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來(lái)降低血糖 2）

2、GLP-1還有減緩細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其再生的獨(dú)特作用 3）GLP-1還能減慢胃排空速度，通過(guò)作用下丘腦，抑制食欲。GLP-1 GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰島成熟細(xì)胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄和胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP3535LigandLigand

3、sACsGTPATPcAMP PKACa2+NFAT-PNFATCalcineurinCREB-PNFAT-RECREF-LuciferseR-LuciferseGLP-1 Receptor3535報(bào)告基因檢測(cè)原理3535LigandLigandsACsATPcAM試驗(yàn)原理采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被cAMP特異性抗體，樣品中cAMP將和標(biāo)準(zhǔn)HRP-cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔條上cAMP特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中cAMP的含量成負(fù)相關(guān)。以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對(duì)照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度，求得供試品相對(duì)生物活性。試驗(yàn)原

4、理采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被c操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/孔，室溫1 h;2、洗滌后，向不同孔中分別cAMP、對(duì)照或細(xì)胞裂解上清品（樣品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50 ul/孔，室溫作用2h；4、洗滌后，向孔中加入TMB溶液， 200 ul/孔，室溫作用30min；5、向孔中加入終止液，100 ul/孔，測(cè)定OD450nm/570nm操作程序：1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/數(shù)據(jù)與結(jié)果 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（1）測(cè)定各濃度梯度下各孔對(duì)照品和供試品相應(yīng)的吸光值，并分別計(jì)算平均值；（2）以吸光值為

5、縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對(duì)照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度；對(duì)照品EC50；測(cè)試樣EC502. 數(shù)據(jù)處理： 供試品相對(duì)生物活性（%）=對(duì)照品EC50/供試品EC50100% 其中：對(duì)照品和供試品的EC50分別表示對(duì)照品和測(cè)試樣的半效量的濃度。四參數(shù)方程中的C值即相當(dāng)于半效量的濃度(EC50)。數(shù)據(jù)與結(jié)果 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：典型的測(cè)定結(jié)果及回歸曲線典型的測(cè)定結(jié)果及回歸曲線酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測(cè)CygnusF550CHOHCPELISAKit二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測(cè)CygnusF550CH宿主細(xì)胞蛋白污染物 CH

6、O宿主蛋白殘留 E-coli宿主蛋白殘留 酵母菌宿主蛋白殘留 HEK293宿主蛋白殘留宿主細(xì)胞蛋白污染物 CHO宿主蛋白殘留2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜將2D Gel上的全蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用多克隆抗體孵育后進(jìn)行Western Blot化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，以確認(rèn)多克隆抗體能夠與哪些宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合通過(guò)Western Blot檢測(cè)結(jié)果（多抗能檢測(cè)到的HCP數(shù)量）與2D膜上檢測(cè)結(jié)果（總HCP數(shù)量）的比較，得出用于評(píng)價(jià)檢測(cè)的多克隆抗體特異性及適用性的Match Rate評(píng)估HCP定量用多克隆抗體的特異性2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜評(píng)估HCP定酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分

7、析中的應(yīng)用-課件試驗(yàn)原理采用雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗CHO CHP多抗，免疫反應(yīng)構(gòu)成為夾層式結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標(biāo)記抗體。反應(yīng)結(jié)束后清洗酶標(biāo)板去除未結(jié)合反應(yīng)物，添加TMB底物顯色，吸光值與樣品中CHO宿主蛋白的含量成正相關(guān)。試驗(yàn)原理采用雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗C檢測(cè)步驟：（1）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 L抗CHO HCP多抗-HRP；（2）從標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、對(duì)照和樣品中吸取50 L 上清加入到已標(biāo)記好的反應(yīng)孔中；180rpm下室溫、振蕩培養(yǎng)2h；（3）棄去孔內(nèi)溶液，每孔加350 L 洗滌液，重復(fù)洗滌4次；（4）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 L TM

8、B底物溶液，于室溫孵育30min；（5）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 L終止液；依序讀取OD450/650 nm吸收值(空白對(duì)照孔調(diào)零)。（6）數(shù)據(jù)處理：根據(jù)測(cè)定每孔標(biāo)準(zhǔn)液吸光值繪制四參數(shù)邏輯曲線，然后根據(jù)樣品吸光值計(jì)算出樣品中HCP濃度。檢測(cè)步驟：（1）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 L抗CHO H酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用-課件ELISA法研究藥物作用靶點(diǎn)（GPb/a受體）實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)原理，先在96孔板上包

9、被纖維蛋白原，然后同時(shí)加入GPIIb/IIIa受體和待測(cè)樣品，再加酶標(biāo)抗體與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，最后加入底物，酶作用于底物顯色，在405nm測(cè)得OD值，OD值與GPIIb/IIIa受體量成正比。如果樣品與GPIIb/IIIa 受體結(jié)合，就會(huì)降低纖維蛋白原與受體的結(jié)合，導(dǎo)致所測(cè)的OD值降低。ELISA法研究藥物作用靶點(diǎn)（GPb/a受體）實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟： 首先將纖維蛋白原（10 g/ml）用buffer A（0.1 M Na2CO3, PH 9.5）包被于96孔板上（100 l/well）（空白對(duì)照: 不包被纖維蛋白原），4C孵育過(guò)夜；TACTS（0.02M Tris- HCl, PH

10、 7.5，0.15M NaCl，1mM CaCl2,0.02% NaN3,0.05% Tween 20）沖洗一次，每孔200l，3min；用含1% BSA 的TACTS 在37C封閉1h（200 l/well）,TACTS洗三次；整合素IIb3（20 g/ml、50 L/well）加一定濃度的待測(cè)樣品50 l作為樣品組；加孵育液做陰性對(duì)照組；37C下孵育2h；TACTS 洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗體，含0.5%BSA ,TACTS稀釋，1:2000(體積比)，100L /孔）37C下孵育1h；實(shí)驗(yàn)步驟： TACTS 洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA ,TA

11、CTS稀釋，1:1000，100L /孔），37C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液(PNPP)1mg/ml，用buffer B溶解，200L/well），37下孵育30min；加入50L 3M NaOH(稱0.6g加5ml蒸餾水)終止反應(yīng)；5min內(nèi)405nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。TACTS 洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，數(shù)據(jù)處理通過(guò)以下公式計(jì)算抑制率：(XY)/(X-Z)100%。X代表生理鹽水組OD值；Y代表樣品組OD值；Z代表空白對(duì)照組OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果都用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析。p1mg/ml時(shí)較穩(wěn)定。7. buffe

12、r B（底物緩沖液）：定容100ml，PH 三、卡那霉素殘留檢測(cè)卡那霉素檢測(cè)試劑盒三、卡那霉素殘留檢測(cè)卡那霉素檢測(cè)試劑盒2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須使用時(shí)，應(yīng)選擇安全性風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低抗生素，使用抗生素種類不得超過(guò)1種，且產(chǎn)品后繼工藝應(yīng)保證可有效去除制品中抗生素，去除工藝應(yīng)該驗(yàn)證。（4）生產(chǎn)過(guò)程中使用抗生素時(shí)，成品鑒定中應(yīng)檢測(cè)抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限制。上述的生產(chǎn)過(guò)程包括種子培養(yǎng)活化，發(fā)酵，純化等所有的步驟，所以種子活化階段是算在生產(chǎn)過(guò)程中的。2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)盡可能避免使用試驗(yàn)原理采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔

13、條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的含量。試驗(yàn)原理采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的

14、位置。操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-255、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml 到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50ml/孔，再加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25避光環(huán)境中反應(yīng)40min。6、洗板：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250ml/孔，充分洗滌45次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。8、測(cè)定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，

15、在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml 到對(duì)應(yīng)的微孔中定量分析（1）百分吸光率的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）B/B0100% B標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B00ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實(shí)際殘留量

16、。定量分析（1）百分吸光率的計(jì)算卡那霉素測(cè)定方法驗(yàn)證 檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定藥盒卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品卡那霉素測(cè)定方法驗(yàn)證 檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定卡那霉素在樣品溶液中的回收率試驗(yàn)濃度(ppb)回收率(%)Mean(%)CV(%)20.097.55 95.11 98.71 99.15 101.84 97.69 98.34 2.25 5.095.79 82.90 88.29 103.64 98.72 88.42 92.96 8.31 1.088.52 89.67 89.41 89.41 92.40 86.14 89.26 2.26 卡那霉素在樣品稀釋液中的回收率(n=6)卡

17、那霉素在樣品溶液中的回收率試驗(yàn)濃度回收率MeanCV20.精密度試驗(yàn)試驗(yàn)濃度（ppb）20.05.01.0實(shí)測(cè)值準(zhǔn)確度(%)實(shí)測(cè)值準(zhǔn)確度(%)實(shí)測(cè)值準(zhǔn)確度(%)板內(nèi)25.55102.204.9298.350.9999.2124.8599.415.12102.381.07107.0725.76103.064.9398.620.8989.4225.37101.504.6192.280.8787.0924.7198.865.34106.730.9898.3925.80103.204.9799.310.8888.19Mean25.34101.374.9899.610.9594.89CV(%)1.814

18、.818.36板內(nèi)24.9499.765.60112.050.9089.5424.6198.455.51110.260.9494.3825.42101.675.15103.091.0099.6225.42101.674.7494.721.06106.3924.3397.314.7294.300.9998.8923.7795.065.05101.010.8888.37Mean24.7598.995.13102.570.9696.20CV%2.617.327.08板間CV(%)2.476.117.43卡那霉素稀釋樣本競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)精密度試驗(yàn)試驗(yàn)濃度（ppb）20.05.01.0實(shí)測(cè)值準(zhǔn)確度四、人胰島素原殘留檢測(cè)Mercodia Proinsulin ELISA kit 四、人胰島素原殘留檢測(cè)Mercodia Proinsulin目前重組人胰島素生產(chǎn)主要以E.coli表達(dá)人胰島素原，初步純化后變復(fù)性，經(jīng)胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)協(xié)同酶切，去掉前導(dǎo)肽和C-肽，形成有活性的胰島素，并進(jìn)一步純化精制而成。上述工藝制備所得人胰島素產(chǎn)品中可能殘留人胰島素原、C-肽等人胰島素