酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法課件

1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 生物體系中的化學(xué)測(cè)量裴丹青03081152酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 生物體系中的化學(xué)測(cè)量裴丹青0308115 復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測(cè)量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗(yàn)、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。 經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡(jiǎn)單的吸光光度法）是以簡(jiǎn)單離子或分子為檢測(cè)對(duì)象的常量或微量分析，面對(duì)生物體系成分復(fù)雜且待測(cè)物濃度較低的測(cè)試條件則往往無能為力。 于是，一系列針對(duì)生物體系中化學(xué)成分的測(cè)量方法應(yīng)運(yùn)而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識(shí)與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。 復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)

2、的化學(xué)測(cè)量是揭示生命奧秘的重要 什么是 酶聯(lián)免疫分析技術(shù) ELISA的基本原理和方法 ELISA的種類和變化 ELISA的特點(diǎn) ELISA的應(yīng)用實(shí)例 什么是 酶聯(lián)免疫分析技術(shù) ELISA的基本原理和方法 EL 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzy

3、matic techniques ) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù) 。 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlma一、基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）酶作用的底物（顯色劑）一、基本原理在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑： 測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗

4、原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。 測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免 其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。 其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。 其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。二、酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng).二、酶及其底物酶

5、 底 物顯色反應(yīng) 測(cè)定波長(zhǎng) 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍(lán)色 405420 -半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 熒光黃色 360,450420 酶 底 物顯色反應(yīng) 測(cè)定波長(zhǎng) 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲ELISA的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）

6、競(jìng)爭(zhēng)法 （四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA ELISA的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成抗體待測(cè)抗原酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物 徹底洗滌未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體 加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定

7、性或定量測(cè)定獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相洗滌除去未結(jié)合的加 間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法 間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體 加待檢標(biāo)本: 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體 加底物顯色 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定包被固相載體: 加待檢標(biāo)本: 加酶標(biāo)抗抗體:加底物根據(jù)顏色反（三）競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體

8、。（三）競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，用已知特異性抗體包被固相載體 測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌除去未結(jié)合的成分 加底物顯色分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比， 計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量用已知特異性測(cè)定管加待測(cè)抗原和對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原分別洗此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 。該測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告集團(tuán)的酶。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏菌 ）植物毒素如罌粟鹼

9、、嗎啡、藻類毒素例如殺暝松（ FN ）、鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ELISA的應(yīng)用實(shí)例載體連接形成固相抗體間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。 對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物

10、后顯色反應(yīng)較弱。 此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 。 特點(diǎn)一：靈敏性 該測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告集團(tuán)的酶。眾所周知, 酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。 例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為510g/ml 。 特點(diǎn)一：靈敏性特點(diǎn)二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之

11、間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。 特點(diǎn)二：特異性生物體系中的化學(xué)測(cè)量眾所周知, 酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測(cè)量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗(yàn)、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 ?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識(shí)與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合

12、，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。該抗原的定性或定量測(cè)定再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。該測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告集團(tuán)的酶。固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏菌 ）4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試

13、劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzymatic techniques ) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù) 。 例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。生物體系中的化學(xué)測(cè)量 例如乙肝病毒中的表面抗原（HELISA應(yīng)用實(shí)例ELISA應(yīng)用實(shí)例 飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定 飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素， 簡(jiǎn)曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢

14、（如沙門氏菌 ） 甲胺磷殘留分析 甲基對(duì)硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè) 飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定 甲胺磷殘留分析 ELISA在飼料河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（ FN ）、 甲氟磷酸異已酶（ SOMAN ）、 草不綠（ Alachor ）、 西維因（ Carbaryl ）、 多菌靈及克菌丹（ Captan ）等。農(nóng)藥的檢測(cè)：河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘 主要有除 ELISA檢測(cè) “非典型肺炎”冠狀病毒 ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用 ELISA法檢測(cè)幽門螺桿菌抗體 ELISA檢測(cè) “非典型肺炎”冠狀病毒 ELISA在結(jié)