實(shí)驗(yàn)原理及操作

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)原理及操作第1頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆彰庖呙讣夹g(shù)的測(cè)定原理。掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會(huì)利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法，定量測(cè)定抗體或抗原。了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義及應(yīng)用價(jià)值。第2頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）: 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 特點(diǎn)：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)

2、、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定。第3頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三免疫酶技術(shù)(enzyme immunoassay)： 是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。 就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。第4頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP) 堿

3、性磷酸酶（AP）。第5頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三ELISA檢測(cè)抗原 Ag + Ab* Ag-Ab*第6頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三ELISA檢測(cè)抗體 Ab + Ag* Ab-Ag*第7頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三ELISA檢測(cè)抗體Ag + Ab1 Ag-Ab1Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2* 第8頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三第9頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗原第10頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)

4、13分，星期三固定OD值第11頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三第12頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三實(shí)驗(yàn)材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/L PBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/L H2S04酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/人）第13頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三三、操作步驟包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到

5、酶標(biāo)板中，100l/孔，放入濕盒中，4過夜。 次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原?？乖?00ul/孔濕盒中，4過夜酶標(biāo)板第14頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三抗原與抗體的預(yù)孵育制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度的抗原最終為50l，分別在各抗原孔中加入250l一定濃度的抗體，放入37恒溫培養(yǎng)箱中30 min。待測(cè)抗原： 取50l未知濃度的抗原按照同上操作。待測(cè)抗原50ulPBS 50ul50ul 稀釋液50ul50ul100ul 標(biāo)準(zhǔn)抗原250ul抗體稀釋板37，30 min第15頁(yè)，共18頁(yè)，

6、2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三3. 與固相抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100l，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37恒溫培養(yǎng)箱中60 min。洗板3次。 100ul稀釋板酶標(biāo)板37，60 min洗板3次第16頁(yè)，共18頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)13分，星期三4. 酶標(biāo)二抗的結(jié)合 酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37 30min。洗板3次。5. 加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶?jī)?nèi)） 每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37保溫一定時(shí)間。6. 終止反應(yīng) 待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時(shí)間）后，加入終止液， 50ul/孔以終止反應(yīng)。7. 結(jié)果測(cè)定 用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。 以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，