食品質(zhì)量與安全12-醫(yī)學(xué)免疫學(xué)-2課件

1、 主講人：劉曉波 基礎(chǔ)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系 email:xiaobo9412 Tel品免疫學(xué)第十章 抗原和抗體的 制備與應(yīng)用一、抗原概念（主要針對(duì)適應(yīng)性免疫） 進(jìn)入機(jī)體能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答、產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（免疫應(yīng)答產(chǎn)物），并能與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)。二、抗原類型（一）根據(jù)抗原基本特性 完全抗原（complement antigen）：大多數(shù)蛋白、 細(xì)菌、病毒等。 不完全抗原或半抗原：僅具有抗原性。大多數(shù)多糖、 類脂和某些藥物分子（二）其它分類 天然抗原和人工抗原： 顆粒性抗原和可溶性抗原： 蛋白質(zhì)抗原、多糖抗原和多肽抗原：1、顆粒天然抗原的制備（1）

2、細(xì)菌抗原的制備 過(guò)程: 復(fù)蘇細(xì)菌檢驗(yàn)細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)菌 滅活菌體收獲抗原（2）細(xì)菌鞭毛抗原制備 培養(yǎng)鞭毛豐富的細(xì)菌加入甲醛于室溫或37 處理24h （3）病毒抗原制備 培養(yǎng)病毒（動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)）鑒定培養(yǎng)物分離純化病毒顆粒（密度梯度離心、凝膠過(guò)濾或親和層析等）滅活病毒（加熱、凍融、pH、有機(jī)溶劑或氧化劑等） （4）紅細(xì)胞抗原 過(guò)程: 新鮮血液與抗凝劑混合離心洗滌數(shù)次以無(wú)菌生理鹽水將血細(xì)胞配成2%-5%血細(xì)胞懸液即可。（5）組織和細(xì)胞粗抗原制備 處理好的細(xì)胞或組織剪成小塊粉碎（高速組織搗碎機(jī)或研磨法）組織勻漿離心，取上清液高速離心，取上清液即可。2、可溶性抗原的制備 過(guò)程: 細(xì)胞破碎（凍融法、

3、超聲法、酶法等） 分離純化離心法、選擇性沉淀（核酸去除、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、電泳等）、親和層析法等鑒定（含量、純度及活性測(cè)定）。 （3）半抗原與載體的連接物理方法：載體與半抗原之間電荷、疏水作用等。 如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素等顆粒 性載體與半抗原。化學(xué)方法：最常用。兩者的某些功能基團(tuán)共價(jià)連接。 兩者本身攜帶的活性基團(tuán)（游離氨基、羧基或 羥基等)直接連接。 雙功能試劑（碳二亞胺、戊二醛、SPDP等） 兩端活性基團(tuán)架橋連接。（4）半抗原與載體的連接物的分析鑒定： 兩者的摩爾比。 方法： 吸收光譜分析法（紫外、紅外、質(zhì)譜、磁共振） 電泳法（SDS） 三、免疫用抗原的

4、處理 佐劑： 1、含義：與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體后,可增強(qiáng) 機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答能力或改變免疫應(yīng)答 類型的物質(zhì)。2、作用機(jī)制： 改變抗原物理性狀，可使抗原緩慢釋放 使抗原易于被巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞處理 1、含義：多個(gè)細(xì)胞克隆在一種抗原的多種表位刺激 下所產(chǎn)生的抗體混合物。 來(lái)源于動(dòng)物免疫血清、恢復(fù)期病人血清或免疫接種人群。2、優(yōu)點(diǎn)：制備簡(jiǎn)單，識(shí)別抗原譜廣，可有效地阻斷 抗原對(duì)機(jī)體的危害。3、缺點(diǎn)：由血清而來(lái)，為血液制品，安全性差； 特異性不高；易發(fā)生交叉反應(yīng)；不均一、 批次變異大。作為靶向性載體不理想。多價(jià)抗原單克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）單克隆抗體6、抗血清的分離和保存 多采用室溫、37 或4

5、自然凝固。 保存：分裝成小包裝 4 ，需過(guò)濾除菌或加入0.1%0.2%NaN3或硫柳汞等防腐劑。16個(gè)月。低溫（-40-20 ）；5年冷凍干燥：510年7、抗體的純化（1）去除雜抗體 免疫吸附法（不含特異性抗原的抗原）（2）IgG分離 鹽析：硫酸銨法 三步法（40%、35%、33%飽和度） 一步法（35%-40%飽和度）：常用陰離子交換劑法：常用DEAE纖維素或QAE纖維素 在pH7.5，Ig帶正電荷而血清中其他蛋白帶負(fù)電荷親和層析法 抗原-Sepharose層析柱：硫氰酸鉀洗脫 SPA-Sepharose層析柱：結(jié)合pH8-9，洗脫pH2-4 SPG-Sepharose層析柱：結(jié)合pH5-7

6、，洗脫pH9-10 A/G-Sepharose層析柱:更廣泛IgG結(jié)合 嗜硫色譜（TAC）：將含硫配基偶聯(lián)于SepharoseCL- 4B等固相載體；配基上砜-硫醚基可與IgG結(jié)合（二）單克隆抗體（Monoclonal Antibody,McAb) 為第二代抗體1、含義：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞克隆在一種表位刺激下所生的 抗體。 來(lái)源于體外細(xì)胞融合技術(shù)建立雜交瘤細(xì)胞株。 Khler和Milstein于1975年發(fā)明，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得，為生物學(xué)領(lǐng)域的革命性的技術(shù)。2、優(yōu)點(diǎn)：特異性高，均一性強(qiáng)，易于大量生產(chǎn)等。3、不足：一般為鼠源性抗體，對(duì)人具有較強(qiáng)免疫 原性。Georeges Koehler Nobel Pr

7、ize in 1984Cesar MilsteinNobel Prize in 19844、制備過(guò)程（1）動(dòng)物免疫： 一般用BALB/C小鼠（對(duì)應(yīng)骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0、 NS-1、Ag8.653等），8-12w，免疫3-4只 大鼠Lou/C（對(duì)應(yīng)骨髓瘤細(xì)胞株Y3-Ag1.2.3） 免疫程序一般同于抗血清制備（2）準(zhǔn)備工作： 骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：HGPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移 酶）缺陷細(xì)胞。 飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cells）準(zhǔn)備：一般為小鼠腹 腔巨噬細(xì)胞。 選擇培養(yǎng)基HAT、融合劑等準(zhǔn)備i、HAT培養(yǎng)基選擇的原理： HAT：HHypoxanthine次黃嘌呤，能被HRPT （次黃嘌呤磷酸核糖

8、轉(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)化成次黃嘌 呤核苷磷酸(IMP)，用于DNA合成。 AAminopterin氨基喋呤，二氫葉酸類似 物，抑制起始合成途徑。 TThymidine 胸腺嘧啶核苷。能被TK （胸苷激酶）轉(zhuǎn)化成脫氧胸腺嘧啶核苷 磷酸(dTMP)，再進(jìn)一步合成核酸。 核苷酸的合成： 起始合成途徑（denovo pathway）：由氨基酸及 其他小分子化合物合成，葉酸作為重要的輔 酶參與這一過(guò)程，氨基喋呤是一種葉酸的拮 抗物，可以阻斷該途徑。（3）分離B細(xì)胞：脾臟分離 加強(qiáng)免疫后3d短頸處死小鼠無(wú)菌操作取脾臟擠壓、研磨制備脾臟勻漿洗滌、計(jì)數(shù)。（4）細(xì)胞融合： 細(xì)胞比例： 骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1:2-1:10，

9、常為1:5（5）培養(yǎng)：將融合物用HAT培養(yǎng)基混合，加入在96孔 板中。待細(xì)胞克隆長(zhǎng)出來(lái)： 骨髓瘤細(xì)胞+脾細(xì)胞融合：存活并生長(zhǎng) 骨髓瘤細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞融合：不能存活，死亡 單獨(dú)骨髓瘤細(xì)胞：不能存活，死亡 單獨(dú)B細(xì)胞：有壽命，最終死亡 脾細(xì)胞+脾細(xì)胞融合：有壽命，最終死亡（6）篩選及細(xì)胞克隆化 鏡檢：融合后3d開(kāi)始，逐孔 換HT培養(yǎng)液：半量 篩選：待孔中克隆細(xì)胞超過(guò)視野1/2時(shí)，取上清 檢測(cè)，確定陽(yáng)性孔。一般為間接ELISA （包被抗原）（7）克隆陽(yáng)性孔細(xì)胞： 有限稀釋法： FACS法（8）再次篩選鑒定，并擴(kuò)大培養(yǎng)該分泌孔細(xì)胞并凍存 同上篩選法；選取強(qiáng)陽(yáng)性孔擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞。 凍存方法：液氮保存（永久

10、），-60-80低 溫保存（臨時(shí)） 大瓶細(xì)胞培養(yǎng)：純度高，但含量低。一般可用無(wú)血 清培養(yǎng)基。中空纖維反應(yīng)器：產(chǎn)量高、易于純化。 （三）基因工程抗體（genetic engineering antibody)或重組抗體 概念：采用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)， 在DNA水平上對(duì)Ig分子進(jìn)行切割、拼接 或修飾，組成新型抗體分子。 優(yōu)點(diǎn)：可降低或消除抗體免疫原性（人源化） 使抗體小型化；去除或減少無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)； 可賦予抗體分子新的生物學(xué)活性。 類別：對(duì)鼠源性抗體的改造 人源化： 小型化： 人鼠嵌合抗體（chimeric antibody)： 改型抗體（reshaping Ab)：又稱CDR移植抗 體(

11、CDR-grafted Ab) 單鏈抗體（ingle chain FV,ScFV）： 單一肽鏈按-linker-L或 L-linker-H順序組成。嵌合抗體、CDR移植抗體三、抗體的應(yīng)用（一）抗體作為檢測(cè)、診斷試劑1、作為親和層析和免疫磁珠配體：可純化抗原或 細(xì)胞等。2、作為研究工作中的分子探針3、作為分析檢驗(yàn)試劑（1）病原微生物檢測(cè)：（2）毒素、農(nóng)藥殘留物、獸藥殘留物等藥物檢測(cè)：（3）微量成分測(cè)定（二）抗體作為藥物制劑1、阻斷、封閉、中和作用：2、特異性結(jié)合靶目標(biāo)，介導(dǎo)其清除或破壞（三）作為靶向或?qū)蜉d體1、免疫毒素（immuntoxin）： Ab+毒素分子（蓖麻毒素等）2、免疫細(xì)胞因子：A

12、b+細(xì)胞因子（IFN等）3、免疫連接物：Ab+化療藥物（阿霉素等）抗體與藥物連接物：Mylotarg（抗CD33抗體 +calicheamicin）抗體與酶連接物：ADEPT(antibody directed enzyme prodrug therapy,抗體導(dǎo)向的 酶-前藥療法）：Ab+胞嘧啶脫氨酶可使 5-Fu轉(zhuǎn)化成5-Fu。 4、免疫微?；蛎庖呒{米粒： 將載藥物的微粒或納米粒與抗體結(jié)合即成； 具有載藥量大、控緩釋性、靶向性等。5、免疫脂質(zhì)體： 將載藥物的脂質(zhì)體與抗體結(jié)合即成6、抗體靶向或?qū)虻暮怂徂D(zhuǎn)運(yùn)載體： 聚乙烯亞胺等第十一章 抗原抗體反應(yīng)與非標(biāo)記免疫分析 血清學(xué)試驗(yàn)（serolog

13、y）一、含義：抗原與抗體的體外特異性結(jié)合反應(yīng)。二、特點(diǎn)或一般規(guī)律：高度特異性：抗原與抗體結(jié)合的專一性、互補(bǔ)性。 抗原表位與抗體V區(qū)的CDR互補(bǔ)性地結(jié)合。 抗體的結(jié)合能力： 親合力（avidity）： 親和力（affinity）：抗體分子的單一抗原結(jié) 合部位與一個(gè)相應(yīng)表位的結(jié)合能力 抗原結(jié)合價(jià)（antigenic valence）：抗原分子 表面與抗體結(jié)合的表位總數(shù)。 purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.ant

14、ibodyantigenantigen-antibody complex: epitope結(jié)合迅速：數(shù)秒至數(shù)分鐘可完成可逆性: Ab+AgAb-Ag K=-= 抗原-抗體結(jié)合為非共價(jià)鍵結(jié)合，在一定條件下可被解離，因此易受環(huán)境因素影響（溫度、PH值、離子強(qiáng)度等）。 氫鍵（hydrogen bond） 離子鍵（ionic bond） 疏水鍵（hydrophobic interaction） 范德瓦耳斯力（van der Waals interaction）K2K2K1K1Ab-AgAbAg可見(jiàn)性：如抗原-抗體的數(shù)量比例合適，抗原和抗體 分子相互交叉形成網(wǎng)格狀復(fù)合體，此時(shí)出現(xiàn) 肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物（網(wǎng)格

15、：沉淀物或凝集物）三、影響抗原抗體可見(jiàn)反應(yīng)的因素 抗原-抗體可見(jiàn)反應(yīng)階段： 特異性結(jié)合階段：反應(yīng)迅速，可在數(shù)秒-數(shù)分 鐘內(nèi)完成。 可見(jiàn)反應(yīng)階段：小的抗原-抗體復(fù)合物形成大 的肉眼可見(jiàn)復(fù)合物的過(guò)程（）電解質(zhì)：多為生理鹽水（）pH值：（）溫度：（）其它：適當(dāng)?shù)恼鹗幓驍嚢?四、血清學(xué)試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)（1）高度特異性：表位上基團(tuán)性質(zhì)、位置，甚至空間 構(gòu)型影響抗體與抗原結(jié)合。說(shuō)明抗體分子 精細(xì)的分辨能力?。?）通過(guò)人工方法，較容易地獲得更高特異性抗體。（3）對(duì)已知的幾乎所有抗原包括半抗原，可通過(guò)人工 方法，獲得其特異性抗體。 五、抗原和抗體反應(yīng)的類型 凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 非標(biāo)記免疫技術(shù) 補(bǔ)體參與的反應(yīng) 中和反

16、應(yīng) 免疫標(biāo)記技術(shù) （一）凝集反應(yīng)（agglutination reaction）1、原理：顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體 混合后，在一定條件下可形成肉眼可見(jiàn)的凝 集團(tuán)塊。2、種類：（1）直接凝集反應(yīng)：將顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象 如菌種鑒定、ABO血型鑒定、肥達(dá)氏反應(yīng)等。玻片凝集反應(yīng)：定性試驗(yàn)，通常用已知抗體診斷未 知抗原。此法特異、簡(jiǎn)便、快速，常用于細(xì)菌 分型鑒定和人類ABO血型鑒定。顆粒性抗原抗體可見(jiàn)的凝集塊直接凝集反應(yīng) 試管凝集反應(yīng)：半定量試驗(yàn)。常用已知的標(biāo)準(zhǔn)抗 原為診斷試劑，檢測(cè)血清中特異性抗體及其 含量。 肥大反應(yīng)（Widal test）：檢測(cè)

17、患者傷寒桿菌感 染情況。傷寒和副傷寒沙門(mén)菌菌液為抗原， 檢測(cè)病人血清中相應(yīng)抗體。（2)間接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）吸附在 顆粒性載體（紅細(xì)胞、乳膠顆粒等）表面，載 體顆粒被動(dòng)地發(fā)生凝集反應(yīng)。特點(diǎn)：更靈敏、 微量、快速、操作簡(jiǎn)便等。 常用載體顆粒：紅細(xì)胞、活性碳粒、聚苯乙烯 乳膠顆粒等。據(jù)載體性質(zhì)： 間接血凝試驗(yàn)：載體顆粒為紅細(xì)胞 碳粒凝集試驗(yàn)：載體顆粒為碳粒 乳膠凝集試驗(yàn)：載體顆粒為乳膠據(jù)致敏載體是抗原或者抗體及凝集方式：正向間接凝集試驗(yàn)：抗原致敏載體，檢測(cè)抗體。反向間接凝集試驗(yàn)：特異性抗體致敏載體，檢測(cè) 抗原。間接凝集抑制試驗(yàn)：抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為 檢測(cè)試劑，檢測(cè)標(biāo)本中是否存在

18、與致敏載體結(jié) 合的抗原相同的抗原。協(xié)同凝集試驗(yàn)： 富含SPA的金黃色葡萄球菌+Ig抗體 （二）沉淀反應(yīng)（precipitation reaction）1、原理：可溶性抗原與相應(yīng)抗體混合后，在一定條件 下可形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物。2、種類：（1）無(wú)支持物的沉淀反應(yīng)：環(huán)狀沉淀反應(yīng)、絮狀沉淀 反應(yīng)，免疫比濁。-液相沉淀試驗(yàn)（2）有支持物的沉淀反應(yīng)：以半固體瓊脂凝膠作為介 質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散：可溶性抗原和 抗體在凝膠中擴(kuò)散后在比例合適處相遇， 形成可見(jiàn)的白色沉淀線。-凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)環(huán)狀沉淀試驗(yàn)：如法醫(yī)學(xué)上血跡等。鑒定敏感性較 低，現(xiàn)少用。絮狀沉淀試驗(yàn)：常用于毒素與抗毒素的滴定。免疫比濁法： 原理：抗

19、原抗體復(fù)合物（IC）使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度； 如反應(yīng)液中抗體過(guò)量，形成的IC與抗原量呈 正相關(guān)?？焖俸?jiǎn)便。用于血清IgG、IgA、 IgM、補(bǔ)體C3、C4含量測(cè)定。 種類： 直接比濁測(cè)定：透射比濁、散射比濁。 乳膠濁度測(cè)定： 免疫速率散射濁度測(cè)定法：?jiǎn)蜗颦傊瑪U(kuò)散（single radial immunodiffusion）： 將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制成瓊脂板， 在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散。定量試 驗(yàn)，簡(jiǎn)便、易于觀察結(jié)果；常用于測(cè)定血清Ig和補(bǔ) 體的含量。172361237456雙向瓊脂擴(kuò)散（double immunodiffusion）：將抗原 和抗體分別加入瓊脂凝膠小孔中，二者自由

20、向四周 擴(kuò)散，在相遇處可形成沉淀線。常用于抗原抗體純 度及其相關(guān)關(guān)系分析。 用于抗原性質(zhì)分析： 用于抗體效價(jià)測(cè)定：172361237456免疫電泳：抗原在瓊脂凝膠中電泳后分成不同區(qū)帶， 再進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散的方法。在各區(qū)帶 相應(yīng)的位置形成沉淀弧。172361237456 火箭電泳：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散同電泳結(jié)合的方法。 抗原在含有定量抗體的瓊脂中泳動(dòng)，兩者比 例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。 在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含 量成正比。特點(diǎn)：需時(shí)較短，故可用于快速 沉淀標(biāo)本中抗原的含量。（三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation reaction） 抗體與紅細(xì)胞表面的抗原結(jié)

21、合，加入補(bǔ)體，能 導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，根據(jù)溶血現(xiàn)象判定結(jié)果。 較凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)敏感性高。 試驗(yàn)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）+待檢的未知抗體 （或抗原）+補(bǔ)體 指示系統(tǒng)：溶血素（抗體）+綿羊紅細(xì)胞（SRBC） 如試驗(yàn)系統(tǒng)中抗原+抗體發(fā)生反應(yīng)，則消耗補(bǔ)體，指 示系統(tǒng)中無(wú)補(bǔ)體，SRBC不溶解，則反應(yīng)陽(yáng)性（+） 如試驗(yàn)系統(tǒng)中抗原+抗體不發(fā)生反應(yīng)，則補(bǔ)體存在， 指示系統(tǒng)中有補(bǔ)體，SRBC溶解，則反應(yīng)陰性（-）AgAb補(bǔ)體抗體陽(yáng)性待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應(yīng)紅細(xì)胞溶血素不溶血 +抗體陰性AgAb補(bǔ)體紅細(xì)胞溶血素溶血_（四）中和試驗(yàn) 細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，失去了其生物效應(yīng)。該抗體被稱為中和抗體。此試驗(yàn)可

22、在動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行。 毒素中和試驗(yàn)： 病毒中和試驗(yàn)： 抗鏈球菌溶血素“O試驗(yàn)： （五）免疫標(biāo)記技術(shù) 即標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 1、原理: 用標(biāo)記物(熒光素、酶、放射性同位素、電 子致密物等)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原- 抗體反應(yīng)。 2、特點(diǎn):靈敏度高、快速，可定性、定量和定位. 3、常用種類: 免疫熒光法 酶免疫法 放射免疫測(cè)定法 免疫膠體金技術(shù) 免疫印跡法 發(fā)光免疫分析 一抗：與抗原結(jié)合 二抗：與一抗結(jié)合，即抗抗體第十二章 標(biāo)記免疫技術(shù)及分析應(yīng)用免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling techinique） 即標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 1、原理

23、: 用標(biāo)記物(熒光素、酶、放射性同位素、電 子致密物等)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原- 抗體反應(yīng)。 2、特點(diǎn):靈敏度高、快速，可定性、定量和定位. 3、常用種類: 酶免疫法 放射免疫測(cè)定法 免疫膠體金技術(shù) 免疫熒光法 免疫印跡法 發(fā)光免疫分析 一抗：與抗原結(jié)合 二抗：與一抗結(jié)合，即抗抗體一、酶免疫標(biāo)記技術(shù) 酶標(biāo)記的抗體或抗原作為主要試劑，結(jié)合酶催化反應(yīng)的高效性進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)，通過(guò)酶作用的底物顯色來(lái)判定結(jié)果。（一）特性： 酶催化底物反應(yīng)的放大作用，提高 敏感性。 HRP（辣根過(guò)氧化物酶），AP（堿性磷酸酶） 底物（供氫體，無(wú)色）+ H2O2 氧化型供氫體（顏 色）+H2O 供氫體：鄰苯二胺（O

24、PD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、 DAB等。 酶（二）酶免疫技術(shù)的分類 酶免疫組化：檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原 原 酶免疫技術(shù) 均相酶免疫測(cè)定 酶免疫測(cè)定 固相酶免疫測(cè)定 異相酶免疫測(cè)定 （ELISA） 液相酶免疫測(cè)定 （液體標(biāo)本）均相與異相區(qū)別：異相需分離游離與結(jié)合的 酶標(biāo)記物。1、免疫組化技術(shù)： 檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原。可識(shí)別標(biāo)本中抗原的位置和性質(zhì)，通過(guò)圖像分析定量。 常規(guī)酶免疫組化：光鏡 酶免疫電鏡：電鏡 2、均相酶免疫分析:不需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物（1）EMIT：enzyme-mutiplied immunoassay technique，酶放大免疫測(cè)定技術(shù)?？乖?jìng)爭(zhēng)性

25、結(jié)合。 半抗原與酶結(jié)合形成酶標(biāo)半抗原，保留各自的活力；酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，因空間位阻影響酶活力，導(dǎo)致酶活力下降或消失。 EMIT試劑盒：抗體、酶標(biāo)半抗原、底物。 檢測(cè)樣品：標(biāo)本中的半抗原。 （2）CEDIA：cloned enzyme donorimmunoassay， 克隆酶供體免疫分析。抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。利用重組DNA技術(shù)制備-半乳糖苷酶的片段： 酶受體（enzyme acceptor，EA）：大片段，無(wú)酶活性 酶供體（enzyme donor，ED）：小片段，無(wú)酶活性 ED-EA：具酶活性。 抗原（Ag）與ED結(jié)合形成ED-Ag，可與EA結(jié)合成全酶，具有酶活力；ED-Ag與抗體結(jié)合后，

26、因空間位阻影響全酶形成，導(dǎo)致酶活力下降或消失。 CEDIA試劑盒：ED-Ag、EA、抗體、底物。 檢測(cè)樣品：標(biāo)本中的抗原。 3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 將可溶性抗原（抗體）吸附到固相載體表面，并保持其活性；與標(biāo)本中抗體（抗原）反應(yīng)后，僅需經(jīng)過(guò)固相洗滌，就可實(shí)現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)的分離，大大簡(jiǎn)化操作步驟。為應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最迅速的技術(shù)。 步驟： 包被：抗原（抗體）吸附到固相載體表面。 固相載體：一般聚苯乙烯制品。 封閉：避免非特異性吸附。如BSA 抗原抗體結(jié)合: 多次洗滌: 顯色測(cè)定：加底物。 常用方法： （1）間

27、接法（indirect ELISA）抗原包被，需用標(biāo)記的二抗（2）雙抗體夾心法（sandwich ELISA） 捕獲抗體：包被用抗體 檢測(cè)抗體：適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇 （3）競(jìng)爭(zhēng)法（competing ELISA） 酶標(biāo)Ag與樣品中的非標(biāo)記Ag具有相同的與固相Ab結(jié)合的能力?？乖饕獮樾》肿涌乖亩繙y(cè)定原原測(cè)定管對(duì)照管 （4）捕獲法（IgM-antibody capture ELISA，Mac ELISA） 反向間接ELISA，用于測(cè)定IgM（傳染病早期或新近感染）。 固相載體包被抗IgM二

28、抗（作為捕捉抗體吸附待檢血清中IgM），加入待檢血清，再加入特異性抗原（與被捕捉的IgM結(jié)合），再加入酶標(biāo)抗體。 固相-抗IgM二抗-IgM-特異性抗原-酶標(biāo)抗體 （5）BAS-ELISA BAS=biotin-avidin system，生物素-親和素系統(tǒng)。 是一種反應(yīng)放大系統(tǒng)，BAS-ELISA比普通ELISA敏感4-16倍。i、生物素（biotin，B）：分子量244.3，其咪唑酮環(huán)能與親和素結(jié)合；四氫噻唑吩環(huán)的側(cè)鏈羧基可與抗體等蛋白結(jié)合，也可加以化學(xué)修飾制成活化生物素等。ii、親和素（avidin，A）卵白親和素：抗生物素蛋白，存在于卵清中；分子 量68kd，由四個(gè)相同亞基構(gòu)成，能高親

29、和力地 結(jié)合4個(gè)生物素分子，且高度特異和穩(wěn)定。鏈霉親和素（streptavidin，SA）：鏈霉菌分泌的蛋白；分子量65kd，由4條相同肽鏈構(gòu)成，每一條結(jié)合1個(gè)生物素；非特異性小于卵白親和素。 iii、BAS-ELISA 增強(qiáng)ELISA特異性和敏感性。 常見(jiàn)方法：ABC-ELISA：ABC=avidin biotin peroxidase complex，親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物。 如ABC-ELISA夾心法： 固相抗體+待測(cè)抗原+生物素化抗體+（親和素-生物素化 過(guò)氧化物酶復(fù)合物，即ABC）+底物顯色。BA-ELISA：固相載體+待測(cè)抗原+（生物素化抗體+親和素-酶，即BA）+ 底物

30、顯色。BAB-ELISA：固相抗體+待測(cè)抗原+（生物素化抗體+親和素+生物素化過(guò)酶，即BAB）+底物顯色?？乖坏姆磻?yīng)板加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)記二抗加入底物（6）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT,Enzyme-Linked ImmunoSPOT)：檢測(cè)細(xì)胞因子或特異性抗體分泌細(xì)胞。檢測(cè)抗體特異性B細(xì)胞CK抗體包被的反應(yīng)板 CK加入底物T細(xì)胞產(chǎn)生CK的檢測(cè)加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)的CK抗體4、固相膜免疫測(cè)定 原理：固相膜免疫測(cè)定與ELISA相類似,其特點(diǎn) 是以微孔膜作為固相；常用固相膜為硝 酸纖維素（NC）膜。 類型： 斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA） 免疫印跡法 (Western blot

31、) （1）斑點(diǎn)ELISA (dot-ELISA) （2）免疫印跡法（immuno blotting） 亦被稱為Western blot.是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測(cè)定。該法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測(cè)多種病毒 如HIV 的抗體或抗原。分三個(gè)階段進(jìn)行 :SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移 酶免疫定位 二、放射免疫測(cè)定法(Radioimmunoassay, RIA) 是用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)pg水平。常

32、用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。 缺點(diǎn)：專門(mén)防護(hù)檢測(cè)設(shè)備昂貴。 Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線 7550 30 100110100 1000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）三、免疫熒光法(immunofluorescence assay，IF) 熒光素(FITC、PE等)標(biāo)記抗體形成熒光抗體進(jìn)行 的抗原-

33、抗體反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察或進(jìn)行熒光免疫測(cè)定。 FITC：異硫氰酸熒光素。激發(fā)后發(fā)出黃綠色熒光。 RB200：四乙基羅丹明。激發(fā)后發(fā)出橘紅色熒光。 PE：藻紅蛋白。激發(fā)后發(fā)出橙、紅色熒光。 TRITC：四甲基異硫氰酸羅丹明。激發(fā)后發(fā)出紅 色熒光。（一）熒光抗體染色：免疫熒光細(xì)胞（組織）化學(xué) 技術(shù)。一般采用熒光顯微鏡或Confocal （激光共聚焦顯微鏡）1、直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異染色低。缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特 異熒光抗體。2、間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用 一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體。（二）熒光免疫測(cè)定 一般應(yīng)用熒光分光

34、光度計(jì)測(cè)定。 1、均相法：如雙標(biāo)記法。2、非均相法：可采用與ELISA相似的步驟進(jìn)行。3、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM)： FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。 FACS：fluorescence activated cell sorter。 熒光激活細(xì)胞分選器。流式細(xì)胞儀工作原理4、熒光偏振免疫測(cè)定（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA） 均相競(jìng)爭(zhēng)法，熒光素標(biāo)記的半抗原與標(biāo)本中的待

35、測(cè)半抗原與一定量抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；偏振熒光強(qiáng)度與標(biāo)本中待測(cè)半抗原濃度成反比；可用于小分子半抗原特別是藥物的測(cè)定。5、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（time resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA） 以稀土螯合物如銪（Eu）作為熒光標(biāo)記物；Eu具長(zhǎng)壽命熒光，比背景熒光長(zhǎng)百萬(wàn)倍，待短壽命的本底熒光完全衰退后再進(jìn)行測(cè)定，所得信號(hào)完全為長(zhǎng)壽命螯合物的熒光；其測(cè)定方法相似于ELISA，將Eu標(biāo)記抗體等；所測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光計(jì)。四、發(fā)光免疫分析技術(shù) 將發(fā)光分析與免疫反應(yīng)結(jié)合的一種超微量分析技術(shù)。將魯米諾等發(fā)光劑標(biāo)記抗體（抗原），通過(guò)發(fā)光檢測(cè)抗原（抗體）。 該發(fā)光為化學(xué)發(fā)光（

36、化學(xué)反應(yīng)過(guò)程釋放的能量激發(fā)了發(fā)光劑發(fā)光）。 敏感性高、不需外來(lái)光源、信噪比高、儀器簡(jiǎn)單、分析簡(jiǎn)便快速。 一般用化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。 常用化學(xué)發(fā)光劑：魯米諾（luminol）、吖啶酯等。1、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemiluminescent immunoassay，CLIA） 發(fā)光劑標(biāo)記抗體或抗原。2、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（electro chemiluminescent immunoassay，ECLIA）五、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù) 免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)（immunogic colloidal gold signature，ICS）。 膠體金（colloidal gold）：金鹽被還原成原金 后形成的

37、金顆粒懸液。四氯金酸（HAuCl4）在 檸檬酸鈉等還原劑作用下聚合形成；一般大小 1-100nm，直徑5-20nm呈葡萄酒色，20-40nm 呈深紅色。在堿性環(huán)境下帶負(fù)電荷，與抗體等 帶正電荷的蛋白分子牢固結(jié)合而標(biāo)記蛋白。 高電子密度等特性。 免疫金（immunogold）：膠體金與抗體（抗原） 的結(jié)合物。常見(jiàn)方法1、免疫膠體金組織化學(xué)技術(shù) 因高電子密度特性可借助顯微鏡觀察，定性、定 位測(cè)定組織或細(xì)胞中抗原。 2、免疫膠體金測(cè)定技術(shù)（1）液相法：凝集試驗(yàn)等（2）固相法i、斑點(diǎn)免疫金銀染色法（dot-IGS/IGSS） dot-ELISA與免疫膠體金結(jié)合。 NC膜+待測(cè)蛋白抗原+特異性一抗+膠體

38、金標(biāo)記的 二抗（金顆粒聚集，形成肉眼可見(jiàn)的紅色斑點(diǎn)即 dot-IGS，此時(shí)進(jìn)行銀顯影液增強(qiáng)處理， 為dot-IGSS）。 ii、斑點(diǎn)免疫金滲濾測(cè)定法： 原理完全同于斑點(diǎn)免疫金銀染色法，僅在NC膜下墊以吸水性強(qiáng)的墊料（滲濾裝置）：加抗原后，迅速加入抗體和膠體金標(biāo)記抗體。 特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、可立等結(jié)果。iii、斑點(diǎn)免疫金層析試驗(yàn)： 可設(shè)計(jì)成試紙條，檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速，但僅定性。 試紙條上端（A）和下端（B）均為吸水材料； D：含膠體金標(biāo)記的特異性一抗 T：測(cè)試區(qū)，含另一種抗原特異性抗體 C：對(duì)照區(qū)，含與膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合的二抗 結(jié)果判定：T、C均顯示紅色條帶，陽(yáng)性（+） 僅C顯示紅色條帶，陰性（-）

39、 T、C均無(wú)顯色，試紙條有問(wèn)題六、免疫標(biāo)記新技術(shù)1、免疫-PCR（immuno-PCR） 1992年Sano建立，將抗原抗體反應(yīng)與PCR結(jié)合起來(lái)。 以一段已知序列的DNA片段標(biāo)記抗體，以PCR產(chǎn)物檢測(cè)來(lái)檢查抗原，為迄今最敏感的免疫檢測(cè)方法，比現(xiàn)行ELISA敏感性高102-108。 步驟： 已知序列的DNA片段標(biāo)記抗體： 一般為重組鏈霉親和素-蛋白A（SA-SPA）嵌合體作為連接分子 抗原抗體反應(yīng) PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢查2、免疫傳感器（1)原理： 以抗原抗體分子作為分子感應(yīng)器，利用抗原抗體結(jié)合引起的直接或間接物理化學(xué)變化，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)化（一般為光電信號(hào)），再經(jīng)信號(hào)放大處理即可檢測(cè)。（2）一般組成：

40、分子感應(yīng)器、轉(zhuǎn)導(dǎo)體和電子濾波放大處理器。（3）種類：非標(biāo)記免疫傳感器：抗體或抗原結(jié)合到轉(zhuǎn)導(dǎo)體上，抗原抗體結(jié)合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，該變化可通過(guò)電化學(xué)、光學(xué)等變化表現(xiàn)出來(lái)，從而被檢測(cè)。標(biāo)記免疫傳感器：不直接檢測(cè)抗體抗原反應(yīng)，而是 檢測(cè)免疫復(fù)合物上標(biāo)記物的信號(hào)（如酶、熒光素、 放射性等），其敏感性高于非標(biāo)記免疫傳感器。 常見(jiàn)酶免疫傳感器。 3、免疫芯片 在固相載體上的包被抗體或抗原的微點(diǎn)陣。 其實(shí)質(zhì)：在很小表面積上有序地集成多種抗體或抗原，基于抗原抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)果顯示可用掃描儀或CCD攝像技術(shù)記錄，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，綜合成可讀信息。 第一代抗體芯片Ab Microarray380:

41、集成378種 抗體，可同時(shí)檢測(cè)378種蛋白表達(dá)。 六、免疫分析在食品質(zhì)量與安全檢測(cè)中的應(yīng)用食品分析檢驗(yàn)：食品理化檢驗(yàn)、食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)、 食品營(yíng)養(yǎng)素檢驗(yàn)等。食品理化檢驗(yàn)：物理特性、化學(xué)成分、有害金屬與非金 屬及化合物、農(nóng)藥殘留物、獸藥殘留物、 真菌毒素測(cè)定等5個(gè)系列。1、農(nóng)藥殘留的免疫分析2、獸藥殘留的免疫分析3、食品污染真菌毒素的免疫分析第十三章 細(xì)胞免疫 檢測(cè)技術(shù)一、免疫細(xì)胞的分離1、外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞 分離方法： 葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度離心法： 免疫吸附分離法（Pann

42、ing法，淘篩法） 免疫磁珠分離法 FACS 抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)2、腹腔巨噬細(xì)胞等分離(1) 抗凝靜脈血(2) 加等量NS(4) 密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3) 混勻后，緩慢加于分離液上密度梯度離心法二、免疫細(xì)胞鑒定及功能檢測(cè)1、E花環(huán)試驗(yàn): 檢測(cè)T細(xì)胞數(shù)量。 人T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體（E受體，CD2），故在一定條件下，SRBC能結(jié)合在淋巴細(xì)胞表面，形似玫瑰花環(huán)（E-花環(huán)），常用于測(cè)定T細(xì)胞數(shù)量。 Erythrocyte,紅細(xì)胞T細(xì)胞SRBC2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn): 了解T細(xì)胞的增殖能力。 T淋巴細(xì)胞表面具絲裂原(PHA等)受體,在PHA作用下發(fā)

43、生活化,進(jìn)入有絲分裂期從而增殖(淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,形成淋巴母細(xì)胞):DNA倍增,染色質(zhì)疏松,核仁明顯,核增大;細(xì)胞體積增大,胞漿豐富等?？闪私鈾C(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)。檢測(cè)方法:形態(tài)學(xué)法;同位素法(3H-TdR) 形態(tài)學(xué)法;靜止的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)同位素法(3H-TdR): 將單個(gè)核細(xì)胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8-15小時(shí)加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR), 經(jīng)-液體閃爍儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA的3H-TdR摻入量，推測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的程度。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過(guò)濾測(cè)量放射性靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測(cè)量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)3、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)（51Cr釋放法）：檢測(cè)淋巴 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。5、T、B淋巴細(xì)胞分泌功能測(cè)定：抗體形成細(xì)胞測(cè)定 溶血空斑試驗(yàn)（hemolytic forming cell assay，HFC）抗原包被的反應(yīng)板加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)記二抗加入底物ELISPOT法檢測(cè)抗原特異性B細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)： Enzyme-Linked ImmunoSPOT，ELISPOTCK抗體包被的反應(yīng)板 CK加入底物T細(xì)胞產(chǎn)生CK的檢測(cè)加入淋巴