藥物雜質(zhì)研究方法的建立與應(yīng)用課件

1、藥物雜質(zhì)研究方法的建立與應(yīng)用山東省藥品檢驗所 牛 沖 2010年10月25日 濟(jì)南一 雜質(zhì)研究概述二 雜質(zhì)定義、分類、來源三 雜質(zhì)研究主要內(nèi)容四 雜質(zhì)限度的確定一 雜質(zhì)研究概述 雜質(zhì)研究是藥品研發(fā)的一項重要內(nèi)容，貫穿于藥品研發(fā)的整個過程，與工藝研究、質(zhì)量研究、穩(wěn)定性研究、藥理毒理及臨床研究間存在著密切關(guān)系，直接關(guān)系到上市藥品的質(zhì)量及安全性。它包括選擇合適的分析方法、準(zhǔn)確的分辨與測定雜質(zhì)的含量并綜合藥學(xué)、毒理及臨床研究的結(jié)果確定雜質(zhì)的合理限度。毒性雜質(zhì)安全性普通雜質(zhì)，控制純度有效性 雜質(zhì)產(chǎn)生的原因優(yōu)化工藝BP80： 提出有關(guān)物質(zhì)（related substance）概念BP98： 首次收載有關(guān)物

2、質(zhì)及殘留溶劑檢查通則 增加了雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則 各論項下增加已知雜質(zhì)限度，并提供雜質(zhì)名稱，分子式，分子結(jié)構(gòu)。 純度控制雜質(zhì)控制雜質(zhì)譜控制我國雜質(zhì)研究現(xiàn)狀研究基礎(chǔ)薄弱雜質(zhì)來源不清 雜質(zhì)種類，數(shù)量，來源，產(chǎn)生或引入過程以及降解途徑雜質(zhì)檢查方法缺乏針對性 制定的限度依據(jù)不充分，未結(jié)合雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則要求及實測結(jié)果制定單個雜質(zhì)的限度。國內(nèi)有關(guān)物質(zhì)限度多采用自身對照法，僅限定單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)。這種方法盡管對相對控制藥品的質(zhì)量起到了積極的作用，但與ICH的要求還有差距，并且對于控制復(fù)方制劑中的有關(guān)物質(zhì)則可能存在很大的風(fēng)險。 雜質(zhì)檢查結(jié)果難于評價 未與原發(fā)廠藥品進(jìn)行雜質(zhì)種類和含量的比較研究與分析奧沙利鉑國家標(biāo)

3、準(zhǔn)奧沙利鉑WS1-(X-104)-2003Z注射用奧沙利鉑WS1-(X-090)-2003Z奧沙利鉑甘露醇注射液YBH38062005有關(guān)物質(zhì)甲醇-水=10：90甲醇-水=10：90甲醇-水=7：93檢測波長250nm檢測波長250nm檢測波長249nm雜質(zhì)總和不得過1.0%雜質(zhì)總和不得過1.0%雜質(zhì)總和不得過1.0%左旋異構(gòu)體甲醇-乙醇=7：3無甲醇-乙醇=7：3檢測波長250nm檢測波長250nm不得過0.5%不得過0.5%Ag無無無EP6.0流動相檢測波長限度雜質(zhì)A 乙腈：溶液（10ml 320g/L四丁基氫氧化銨溶液，加1.36g磷酸二氫鉀，用水稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)pH至6.0

4、）=20：80。205nm0.1%雜質(zhì)B 乙腈：溶液（1.36g磷酸二氫鉀和1g庚烷磺酸鈉溶解與1000ml水中，用磷酸調(diào)pH至3.00.05）=20：80215nm0.1%雜質(zhì)C 溶液：乙腈（取0.6ml稀磷酸溶液，用水稀釋至1000ml，用氫氧化鈉溶液或磷酸調(diào)pH至3.00.05）=99：1210nm0.1%單一雜質(zhì)0.1%其他雜質(zhì)總和0.1%雜質(zhì)總和0.3%異構(gòu)體乙醇：甲醇=3：7（V/V）254nm0.1%Ag原子吸收5ppm問題： 簡單地套用含量測定的色譜條件，將主藥的最大吸收波長確定為檢測波長，造成對雜質(zhì)含量的低估甚至漏檢，不能反映產(chǎn)品 的真實質(zhì)量。二 雜質(zhì)定義、分類2.1 雜質(zhì)的

5、定義 任何影響藥品純度的物質(zhì) 藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則 藥物中存在的化學(xué)結(jié)構(gòu)與該藥物不一致的任何成分。 ICH Q3A（R1)1) 有毒副作用的物質(zhì)2) 本身無毒副作用，但影響藥物的穩(wěn)定性和療效的物 質(zhì)3) 本身無毒副作用，也不影響藥物的穩(wěn)定性和療效， 但影響藥物的科學(xué)管理的物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)按照國家有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門依法審查批準(zhǔn)的規(guī)定工藝和規(guī)定原輔料生產(chǎn)的藥品中，由其生產(chǎn)工藝或原料帶入的雜質(zhì)，或在貯存過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。不包括：1）變更生產(chǎn)工藝和原輔料2）摻入或污染的外來物質(zhì)三 雜質(zhì)研究的主要內(nèi)容 原則：結(jié)合在研產(chǎn)品具體的工藝以及產(chǎn)品的特點開展研究。格列美脲（國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-054)

6、-2004Z） 有關(guān)物質(zhì)：雜質(zhì)1: 4-2-3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-1-甲酰胺基乙基苯磺酰胺甲酸乙酯雜質(zhì)2: 4-2-3-乙基-4-甲基-2-氧-3-吡咯啉-1-甲酰胺基乙基苯磺酰胺。BP2008及USP31均未考察雜質(zhì)1，而是甲酸甲酯，經(jīng)檢索，該雜質(zhì)與合成工藝有關(guān)，國內(nèi)合成中間體為甲酸乙酯,故雜質(zhì)1設(shè)置合理。雜質(zhì)譜分析 結(jié)合生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特點分析產(chǎn)品中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)，對產(chǎn)品中雜質(zhì)的來源及結(jié)構(gòu)情況有較為全面的了解建立合適的分析方法 在雜質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，有針對性地選擇合適的分析方法，并對方法進(jìn)行驗證。制定合理的限度 綜合藥學(xué)、藥理毒理及臨床研究結(jié)果確定合理的雜質(zhì)限度，保證藥品的

7、質(zhì)量及安全性。A 原料雜質(zhì)譜分析（1）分析起始原料引入的雜質(zhì) 實例1： 氟尿嘧啶系氟胞嘧啶合成的起始原料或中間體 中國藥典（2010）采用HPLC法對氟尿嘧啶 進(jìn)行控制實例2奧沙利鉑的合成中，草酸作為反應(yīng)物EP6.0和BP2009均對其進(jìn)行了控制。（2） 反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物實例3 奧沙利鉑合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì) 分析藥物中的不穩(wěn)定基團(tuán)和活潑基團(tuán), 初步推測藥物的降解途徑和降解產(chǎn)物。不穩(wěn)定結(jié)構(gòu): 酯鍵(包括內(nèi)酯) 酰胺鍵(包括內(nèi)酰胺) 季銨鍵活潑基團(tuán): 酚羥基 噻吩基 吡啶基 醛基（3） 降解產(chǎn)物 依那普利的結(jié)構(gòu)中含有羧酸乙酯基，該基團(tuán)易發(fā)生水解反應(yīng)，生成羧基，即產(chǎn)生依那普利拉。 依那普利的結(jié)

8、構(gòu)中含有羧基，同時還含有氨基，它們易發(fā)生酰化反應(yīng)生成內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，即產(chǎn)生依那普利二酮哌嗪。 實例4 依那普利降解產(chǎn)物B 制劑中雜質(zhì)譜分析原料引入的雜質(zhì) 除降解產(chǎn)物及毒性雜質(zhì)外，原料藥中控制的雜質(zhì)，制劑中一般不再控制。制劑制備過程產(chǎn)生的雜質(zhì) 考察制劑制備前后雜質(zhì)情況的變化 原輔料配伍作用產(chǎn)生的雜質(zhì) 原料與輔料 復(fù)方制劑各組分制劑貯藏條件下降解產(chǎn)物 穩(wěn)定性考察（加速/長期試驗）實例7 乳糖乳糖的結(jié)構(gòu)中含有半縮醛羥基，它可以轉(zhuǎn)化成醛式，這一結(jié)構(gòu)特征可與含有伯胺類結(jié)構(gòu)的化合物如苯胺類、氨基酸等發(fā)生縮和反應(yīng)，生成腙與糖脎等衍生物，可見，乳糖與含有伯胺類結(jié)構(gòu)的藥物存在著配伍禁忌。對于缺乏相關(guān)研究資料的情況，

9、可以考慮進(jìn)行主藥與輔料/包材之間的相容性試驗，例如，口服固體制劑，可以將主藥和輔料按一定比例混合后，進(jìn)行影響因素試驗。 實例8 奧沙利鉑甘露醇注射液雜質(zhì)A雜質(zhì)B雜質(zhì)CC 仿制藥雜質(zhì)譜的分析 對擬仿藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析 部分品種的國家標(biāo)準(zhǔn)的中有已知雜質(zhì)檢查收入EP 、BP、USP的品種，通過其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可得到更多的已知雜質(zhì)信息雜質(zhì)譜與擬仿品一致或雜質(zhì)種類較擬仿品少， 各雜質(zhì)含量不超過擬仿品 試制品的雜質(zhì)控制達(dá)到了研究目標(biāo) 雜質(zhì)譜與擬仿品一致或雜質(zhì)種類較擬仿品少， 但雜質(zhì)含量超過擬仿品 改進(jìn)工藝，降低雜質(zhì)含量雜質(zhì)譜與擬仿品不一致，有超過鑒定限度的新雜質(zhì)；已知雜質(zhì)含量超過擬仿品 鑒定新雜質(zhì)結(jié)構(gòu) ，

10、分析產(chǎn)生新雜質(zhì)的原因，改進(jìn)工藝，降低雜質(zhì)含量至鑒定限度以下 有明確安全性數(shù)據(jù)的雜質(zhì)，應(yīng)降低其含量至安全范 圍，并在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行控制。 超過質(zhì)控限度的未知安全性雜質(zhì)，應(yīng)提供其安全性論證資料。3.2 分析方法的選擇選擇依據(jù)：待測藥品及雜質(zhì)的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)的控制要求目標(biāo)：專屬、靈敏、準(zhǔn)確、簡捷。 分析方法各有局限，注意不同原理分析方法間的相互補(bǔ)充和驗證。 A 有機(jī)雜質(zhì)分析方法化學(xué)法、光譜法、色譜法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中普遍采用的方法高效液相色譜法（HPLC）薄層色譜法(TLC)氣相色譜法(GC)毛細(xì)管電泳法（CE）由于各種分析方法均具有一定的局限性，因此在進(jìn)行雜質(zhì)分 析時，應(yīng)注意不同原理的分析方法間

11、的相互補(bǔ)充與驗證HPLC與TLCHPLC與CE反相HPLC系統(tǒng)與正相HPLC系統(tǒng)HPLC不同檢測器單一方法不能滿足多個雜質(zhì)的檢測時，可采用兩種或兩種以上的方法互為補(bǔ)充，控制雜質(zhì)。HPLC法：專屬、靈敏、準(zhǔn)確、簡捷外標(biāo)法（雜質(zhì)對照品法） 定量準(zhǔn)確，需雜質(zhì)對照品加校正因子的主成分自身對照法 對校正因子進(jìn)行嚴(yán)格測定，僅適用于已知雜質(zhì)的控制不加校正因子的主成分自身對照法 前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同，有一定誤差峰面積歸一化法 因各雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不相同等因素，可產(chǎn)生較大誤差。 理想的定量方法

12、：已知雜質(zhì)對照品法+未知雜質(zhì)不加校正因子的主成分自身對照法已知雜質(zhì)對主成分的相對響應(yīng)因子在0.9-1.1范圍內(nèi)時，可以用主成分的自身對照法計算含量；超出0.9-1.1范圍時，宜用雜質(zhì)對照品法計算含量，也可用加校正因子的主成分自身對照法。TLC法雜質(zhì)對照品法主成份自身對照法 雜質(zhì)斑點顏色與主成份斑點顏色一致的情況對于無機(jī)雜質(zhì)，各國藥典都收載了經(jīng)典、簡便而又行之有效的檢測方法。對于成熟生產(chǎn)工藝的仿制，采用藥典收載的方法進(jìn)行質(zhì)量考察及控制。對于采用新生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的新藥，鼓勵采用離子色譜法及電感耦合等離子發(fā)射光譜質(zhì)譜（ICP-MS）等分析技術(shù)B 無機(jī)雜質(zhì)的分析方法不揮發(fā)性無機(jī)雜質(zhì)-熾灼殘渣藥典尚未收載

13、的無機(jī)雜質(zhì)（如磷酸鹽、亞磷酸鹽、鋁離子、鉻離子等）的檢測，可根據(jù)其理化特性，采用離子色譜法、原子吸收分光光度法、比色法等檢測某些金屬陽離子雜質(zhì)（銀、鉛、汞、銅、鎘、鉍、銻、錫、砷、鋅、鈷與鎳等）-重金屬對某種（些）特定金屬離子或上述方法不能檢測到的金屬離子作限度要求，可采用專屬性較強(qiáng)的原子吸收分光光度法或經(jīng)典比色法（如藥典已收載的鐵鹽、銨鹽、硒等的檢查法）砷鹽檢測法硫酸根離子、氯離子、硫離子3.3 分析方法的驗證3.3.1 波長的選擇對產(chǎn)品中可能存在的雜質(zhì)的紫外吸收特性進(jìn)行研究。 DAD檢測器根據(jù)各主要雜質(zhì)及主成分的紫外吸收特性，選取響應(yīng)值基本一致的波長作為有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。對不同雜質(zhì)難于找

14、到適宜的檢測波長： 可選擇在不同波長下分別測定 采用加校正因子的主成分自身對照法常見問題簡單套用含量測定項下色譜條件，以主要的最大吸收波長作為有關(guān)物質(zhì)檢測波長。雜質(zhì)在此波長下的吸收可能偏低，甚至無吸收，造成雜質(zhì)含量的低估甚至漏檢。關(guān)于注射用奧沙利鉑有關(guān)物質(zhì)檢查方法的探討傅萍,蘭婉玲,張蕾；藥物分析雜志，2009, 29 (11)3.3.2 溶劑的選擇常用溶劑為甲醇，乙腈截止波長甲醇：205 nm乙腈：190 nm3.3.3 洗脫方式 等度洗脫 梯度洗脫： 雜質(zhì)研究中值得借鑒的手段，有效檢出極性相差懸殊的系列雜質(zhì)。辛伐他汀-等度洗脫新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)34冊 WS1-(X-064)-2003Z色譜柱：A

15、gilent Extend C18色譜柱，柱溫：35，流速：1.0ml/min 流動相：乙腈-0.025mol/L磷酸二氫鈉溶液 （pH4.5）=65：35檢測波長：238nm， 辛伐他汀-梯度洗脫中國藥典2010年版二部色譜柱：luna C18（3m, 33*4.60mm）流速：3 ml/min 檢測波長：238nm流動相：A：乙腈-0.1%磷酸溶液（50：50） B：含0.1%磷酸的乙腈 梯度洗脫時間流動相A（%）流動相B（%）010004.510004.69558.0257511.5257511.610001310003.3.4 驗證項目中國藥典2010 二部 附錄 A 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析

16、方法驗證指導(dǎo)原則A 專屬性專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。溶劑干擾，制劑要考慮輔料干擾反應(yīng)的中間體、立體異構(gòu)體、粗品、重結(jié)晶母液等作為測試品進(jìn)行系統(tǒng)適用性研究，考察產(chǎn)品中各雜質(zhì)峰及主成分峰相互間的分離度是否符合要求強(qiáng)制降解試驗考察方法能否有效檢測出原料藥或制劑中的降解產(chǎn)物。 酸降解: 0.11mol/LHCl溶液 堿降解: 0.11mol/L NaOH溶液 氧化降解: 合適濃度的H2O2溶液 必要時可以加熱或提高濃度 高溫試驗: 通常溫度高于加速試驗溫度的10， 如50、60等 對于原料藥有時需考慮水溶液或混懸液的降解

17、； 考慮在不同的pH值條件下的降解光照試驗: 可采用4500LX強(qiáng)制降解試驗原料藥雜質(zhì)研究中，忽視了合成中間體、粗品在方法專屬性驗證中的作用。合成中間體、雜質(zhì)殘存是原料藥雜質(zhì)的主要來源之一，如建立的方法不能將這類雜質(zhì)分開，便不能用于產(chǎn)品雜質(zhì)的有效控制。強(qiáng)制降解試驗破壞條件太劇烈主藥峰太低，甚至消失，無法觀察其分離情況（破壞10%左右）。關(guān)注10%50%強(qiáng)制降解試驗峰純度可采用二極管陣列檢測器、質(zhì)譜檢測器等檢測峰的純度。以免因分離度不符合要求，導(dǎo)致分析結(jié)果的不準(zhǔn)確。如不具備檢測峰純度的試驗條件，可通過適當(dāng)調(diào)整流動相的組成或比例使各色譜峰的相對保留時間發(fā)生改變，用同一份經(jīng)加速破壞試驗的供試品溶液進(jìn)

18、樣，比較流動相調(diào)整前后雜質(zhì)峰的個數(shù)也可采用TLC法比較同一份經(jīng)加速破壞試驗的供試品溶液 在不同展開系統(tǒng)下的斑點個數(shù)及位置。 遺漏了藥品敏感條件的破壞試驗 如在影響因素穩(wěn)定性試驗中表明某藥品易光解，但在破壞性試驗中卻未考察主峰與光解產(chǎn)物的分離情況。B 靈敏度 檢測限及定量限檢測限：被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。（S/N=3：1） 該驗證指標(biāo)的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質(zhì)限度試驗，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。 定量限：被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。（S/N=10：1） 體現(xiàn)了分析方法是否具備

19、靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確測出。C 精密度 在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度重復(fù)性 在相同條件下由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度中間精密度 在同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測 定結(jié)果的精密度重現(xiàn)性 在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的 精密度D 準(zhǔn)確度測定結(jié)果與真實值或參考值接近程度已知雜質(zhì)：回收率未知雜質(zhì)：與另一成熟方法比對如藥典方法或經(jīng)過驗證 的方法比對E 線性 在設(shè)計范圍內(nèi)，檢測響應(yīng)值與待測物質(zhì)量之間成正比例關(guān)系的程度。F 范圍 檢測方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的高、低濃

20、度或量的區(qū)間 范圍應(yīng)在規(guī)定限度的20%間或定量限至限度的+20% 間，若含量測定和雜質(zhì)檢查同用一套色譜系統(tǒng)，則線 性范圍應(yīng)為雜質(zhì)限度的-20%至含量限度（上限）的+ 20%間G 耐用性耐用性系指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。 耐用性主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。HPLC：流動相的組成比例及pH值、不同廠家或批號的色譜柱、柱效、柱溫、流速TLC：適當(dāng)改變展開劑比例及pH值GC：載氣及流速、不同廠牌或批號的色譜柱、固定相、擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)，待

21、測組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其它難分離物質(zhì)），采用適當(dāng)方法（如主成分降解破壞）制備系統(tǒng)適用性試驗溶液 關(guān)注1：雜質(zhì)分析時應(yīng)格外關(guān)注分離度，并應(yīng)在“色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗”項下對其作出具體規(guī)定。已知雜質(zhì)或輔料與主成份的分離度，不宜將同等濃度的雜質(zhì)與主成分混合，應(yīng)參照限度，一般將1%濃度量的雜質(zhì)加到100%濃度的主成分中，比較客觀科學(xué)地反映樣品中可能存在的雜質(zhì)實際情況?？Х纫蜿P(guān)注2 溶液濃度的確定供試品溶液濃度的確定是雜質(zhì)檢查中的一個重點 濃度越高，越能反映樣品中雜質(zhì)的存在情況。問題：若設(shè)定過高，超載現(xiàn)象 若設(shè)定過低，達(dá)不到檢測目的，觀察不到雜質(zhì)量的變化。對策：從最低檢測限入手，采用

22、“上推法”來確定。 最低檢測限對照溶液供試品溶液 2050倍 2005000倍四 雜質(zhì)限度的確定完全除去雜質(zhì)是不可能的也沒有必要，將雜質(zhì)控制在安全合理的范圍內(nèi)，這個允許的范圍極為雜質(zhì)限度 基本原則：在可行的范圍內(nèi)盡可能低報告限度（Reporting Threshold）：超出此限度的雜質(zhì)均應(yīng)在檢測報告中報告，并應(yīng)報告具體的檢測數(shù)據(jù)。鑒定限度（Identification Threshold）：超出此限度的雜質(zhì)均應(yīng)進(jìn)行定性分析，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。質(zhì)控限度（Qualification Threshold）：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中一般允許的雜質(zhì)限度，如制訂的限度高于此限度，則應(yīng)有充分的依據(jù)。ICH Q3A（R）； ICH Q3B（R）；化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則 原料藥雜質(zhì)限度最大日劑量報告限度鑒定限度質(zhì)控限度2g0.05%0.10%或1.0mg （取最小值）0.15%或1.0mg （取最小值）2g0.03%0.05%