生物顯微技術(shù)3- 細胞化學(xué)和組織化學(xué)課件

1、第三章 細胞化學(xué)和組織化學(xué)細胞化學(xué)和組織化學(xué)(cytochemistry and histochemistry)技術(shù)是以細胞學(xué)、組織學(xué)為基礎(chǔ)，運用物理的和化學(xué)的方法來顯示細胞組織結(jié)構(gòu)中各種化學(xué)物質(zhì)(如無機物、脂類、蛋白質(zhì)、維生素、核酸、酶等)的定性、定位、定量的技術(shù)，從而分析、研究生物在生理或病理狀態(tài)下，細胞和組織的代謝、功能及形態(tài)的變化規(guī)律。組織化學(xué)源自比利時植物學(xué)家RaspaiI(1830年)發(fā)表在生理學(xué)中使用顯微鏡觀察化學(xué)物質(zhì)的論著。初期(1830-1870年)的組織化學(xué)主要解釋生物界中的生理現(xiàn)象。(l890-1920年)隨著顯微鏡的改進和組織化學(xué)染色技術(shù)的發(fā)展，組織化學(xué)開始脫離生理學(xué)而

2、趨向于闡明組織細胞的結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成，即從生理組織學(xué)的概念轉(zhuǎn)為顯微化學(xué)。差不多與此同時(1900-1935年)，發(fā)現(xiàn)疾病組織中出現(xiàn)的物質(zhì)變化，更促進了化學(xué)技術(shù)在病理學(xué)染色方法中的應(yīng)用，也豐富了在顯微鏡下顯示無機物、色素、脂類、糖類、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的組織化學(xué)內(nèi)容，此后又出現(xiàn)了酶的組織化學(xué)等。由此可見，“組織化學(xué)”一詞的含意是隨時代而變化的，由定位趨向于與定量相結(jié)合的研究。第一節(jié) 細胞化學(xué)和組織化學(xué)的基本方法與常規(guī)的組織學(xué)方法一樣，細胞化學(xué)和組織化學(xué)方法也同樣需要經(jīng)過取材、固定、制片、染色等過程，只是要求更加嚴(yán)格。一、取材組織塊不宜過大，光鏡標(biāo)本一般為1.5cmlcmO.3cm大小，電鏡標(biāo)本的大

3、小約在05mm左右。酶組化之目的使用時，最好在低溫的環(huán)境下(04)操作。(一)常用的細胞和組織化學(xué)固定劑的配制l、Baker甲醛-鈣固定液(固定時間24/小時)商品甲醛10ml，10%氯化鈣l0ml，蒸餾水80ml， 此固定液為細胞和組織化學(xué)技術(shù)中最常使用的固定液，適合各種染色方法。 2、Lillie磷酸緩沖-甲醛液3、多聚甲醛-磷酸緩沖固定液(多聚甲醛效果優(yōu)于甲醛)4、戊二醛磷酸緩沖固定液(固定時間1 60分鐘，適用于電鏡)5、甲醛-蔗糖-磷酸緩沖固定液(適用于多糖類及蛋白質(zhì))以上固定液都必須在冷的環(huán)境下(0 4 )工作。(二)常用的固定方法1、浸泡固定法：將固定液置于0一4C冰箱中預(yù)冷，檢

4、材浸入冷固定液中2一12小時(在冰箱中進行)或者更長。2、原位冷固定法：將動物麻醉后，在活體情況下，在組織上加冰后，一邊快速取材，一邊向組織器官滴加預(yù)冷的固定液，檢材取出后，再用浸泡法固定30分鐘-1小時，甚至更長時間。3、灌注固定法：從心血管途徑將固定劑灌注到全身或某一個器官，使細胞保持生活時的狀態(tài)而不發(fā)生移位，固定后再迅速取材。三、制 片涂片法、石蠟切片法、冰凍切片法最常使用的為恒冷箱冰凍切片法。四、注意事項1、實驗所用的器械、器皿都必須清潔無污染。2、配制試劑時應(yīng)使用雙蒸餾水。3、固定、取材都應(yīng)在冷的環(huán)境下進行。4、各種試劑的pH值都要調(diào)準(zhǔn)，否則影響反應(yīng)結(jié)果。5、所用試劑要純，都必須達到

5、分析純(AR級)。6、同時、同條件情況下做陰性和陽性對照。7、了解和掌握被檢組織中所要測定的化學(xué)物質(zhì)或酶的各種特性，做到胸中有數(shù)，正確分析實驗結(jié)果。以下介紹McGee-Ruseell核固紅法。1、操作步驟(1) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。(2)核固紅染液染色2一10分鐘。 核固紅染液的配制：核固紅2g，蒸餾水100ml洗滌2次，剩下約0.25g核固紅殘余物，再溶于蒸餾水100ml。(3)蒸餾水稍洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。2、結(jié)果：鈣鹽沉積處紅色；其他組織深淺不同的淡粉紅色。3、注意事項(1)鈣鹽易被酸性溶液溶解，適宜于用中性甲醛溶液固定，固定時間不宜過長，以免甲醛溶液酸化影響結(jié)果。(2)鐵妨

6、礙鈣的顯示，要避免使用鐵質(zhì)容器。第三節(jié) 有機物的檢測方法一、糖類染色方法糖類廣泛存在于機體的組織中，化學(xué)成分復(fù)雜，種類繁多，分為單糖、多糖、黏多糖、糖蛋白、黏蛋白、糖脂。糖原是天然存在的多糖，為儲存糖；大量存在于肝細胞、骨骼肌、心肌內(nèi)。糖類容易溶解于水，因此不能選擇水溶性固定液固定組織。糖原的常規(guī)染色為過碘酸-Schiff（PAS）反應(yīng)法1、染色步驟(1) 經(jīng)常規(guī)組化固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液固定組織。(2) 常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟至水。(3) 1%過碘酸液氧化10分鐘。(4) 自來水充分洗3分鐘，蒸餾水過洗。(5) 入Schiff液10一20分鐘(遮光)。 Schiff液

7、的配制：堿性品紅1g ，蒸餾水(煮沸) 200mI，振蕩5分鐘，冷卻至50過濾，加入lmol/LHCl20ml，冷至25 時加偏重亞硫酸鈉46g， 遮光放置12一24小時后，加入活性炭(吸色) 2g(若液體顏色較淡可省去此步)，搖蕩1分鐘后過濾，將濾液遮光保存在04 處備用。(6)自來水流水沖洗15一20分鐘，顯色(紅色)。(7)蘇木精復(fù)染5分鐘。(8)流水沖洗5一10分鐘。(9)常規(guī)脫水、透明、封片。 2、結(jié)果：糖原及PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)為紅色；其他為紫藍色。 3、注意事項(1)Schiff液的配制是本方法的關(guān)鍵，否則將不顯色。(2)SO2充分時，能使堿性品紅變成無色品紅，此時配出來的溶液呈淡

8、黃色清亮液體，可以省去活性炭吸色這一步驟。在使用中染液逐漸變無色。 (3)反應(yīng)的強弱與氧化的時間及氧化的強度有關(guān)。過碘酸的濃度不宜過高，氧化時間不能太短，也不能太長，要適當(dāng)掌握。一般氧化10-12分鐘。 (4)一定要做好對照。二、核酸的顯示方法核酸是細胞內(nèi)染色質(zhì)和核仁不可缺少的組成部分。其主要成分為核苷酸，核苷酸由磷酸和核苷組成。根據(jù)生物功能及化學(xué)結(jié)構(gòu)可以將細胞內(nèi)的核酸分為兩種，核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸（DNA)。RNA主要存在于胞質(zhì)中，核仁、核質(zhì)、染色體中含量少，在蛋白質(zhì)的合成上起著重要作用。DNA大部分存在于細胞核中，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。RNA、 DNA的顯示的常用方法有Feulge

9、n法、甲基綠-派洛寧法等。1、Feulgen法反應(yīng)原理：標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團，故可呈現(xiàn)出紫紅色。也就是說, DNA經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。 2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3 注意事項： （1） 對照切片的制做（2） 固定劑的選擇：一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen反應(yīng)，以O(shè)sO4和Carnoy效果較好（3）水解時間：適當(dāng)?shù)乃鈺r間一般為812min。（4

10、）Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。（5）5%亮綠淡復(fù)染，使胞漿及其它組織呈綠色。2、改良的甲基綠-派洛寧法甲基綠-派洛寧染色的原理并不十分明了，有的學(xué)者認為甲基綠染DNA，派洛寧染RNA不是化學(xué)作用，而是兩種核酸的聚合程度，甲基綠染高聚分子的DNA，而派洛寧染低聚分子的RNA。而有的學(xué)者認為，甲基綠和派洛寧在水中分離后，都產(chǎn)生帶正電荷的離子，甲基綠電離后產(chǎn)生兩個正電荷，堿性較強，與細胞核結(jié)合；派洛寧電離后產(chǎn)生一個正電荷，堿性較弱，與細胞質(zhì)結(jié)合。1、操作步驟：略2、結(jié)果：RNA紅色，DNA藍綠色。甲基綠-派洛寧染色液的配制:目前應(yīng)用 1. 用于蛋白質(zhì)的一般定性 確定是否為蛋白

11、質(zhì) 確定蛋白質(zhì)的酸堿性 顯示蛋白質(zhì)的特殊基團 2. 用于蛋白質(zhì)功能定性和定位：目前,研究蛋白質(zhì)功能定性和定位時多用酶組織化學(xué)法,配體受體結(jié)合法,免疫組化法以顯示特殊的蛋白質(zhì). 細胞化學(xué)和組織化學(xué)顯示蛋白質(zhì)，只能利用某些氨基酸的反應(yīng)。由于在動物組織中通常沒有游離的氨基酸，所以如用測定某種氨基酸方法得到陽性結(jié)果，即表明它是某一類蛋白質(zhì)。顯示蛋白質(zhì)的汞-溴酚藍法顯示堿性蛋白質(zhì)的堿性固綠法顯示蛋白質(zhì)結(jié)合性氨基的茚三酮- Schiff反應(yīng)顯示酪氨酸、色氨酸、組氨酸的偶聯(lián)四氮鹽反應(yīng)四、脂類染色法組織中的脂類 ：單純脂類 (脂肪酸)、醇的化合物(如:甘油三脂等)、 復(fù)合脂類 如磷脂(卵磷脂,腦磷脂) 、脂類

12、（鞘磷脂）、 糖脂(腦苷脂,神經(jīng)苷脂) 、衍生脂類（膽固醇）、 腎上腺素 、性激素 顯示脂類的基本原理 ：用易溶于脂類的染料,使之溶于所檢的脂質(zhì)(如脂滴)中,使組織內(nèi)的脂類著色. 實驗舉例:蘇丹黑B法 原理：蘇丹黑為偶氮染料,具有脂溶性,可溶于無水酒精,但不溶于水(常用70%酒精飽和液)。當(dāng)組織切片入染液時,蘇丹黑B便離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴中)使組織內(nèi)脂類著色。標(biāo)本: 兔腎上腺和睪丸橫冷箱切片,10m厚,不固定(或用10%Formalin固定10分鐘后水洗)。方法 ： 入蒸餾水洗 于70%乙醇內(nèi)涮洗 入蘇丹黑B 70%B飽和液,染510分鐘 于50%酒精內(nèi)浸洗 蒸餾水中洗 入May

13、er蘇木精(復(fù)染細胞核)1分鐘 自來水沖洗510分鐘 入蒸餾水 甘油明膠(或Apathy糖膠)封固 結(jié)果：細胞內(nèi)脂滴均呈黑色 五、色素染色法色素分為人為色素和自生性色素。人為色素是由于固定劑與組織中某些成分相作用而產(chǎn)生。例如福爾馬林色素，這種色素在切片染色前可以酒精苦味酸或氫氧化鈉水溶液處理除去；而含有升汞固定液所產(chǎn)生的汞色素則可用碘處理除去，含鉻酸鹽固定而產(chǎn)生的黃色沉著物則可用酸酒精處理除去。在某些病理情況下，細胞代謝所產(chǎn)生和沉著的色素，如脂褐素、黑色素、含鐵血黃素、嗜鉻、嗜銀顆粒及組織內(nèi)的微量金屬離子等，則需要一些特殊染色加以證明。如：黑色素染色法：黑色素是深褐至黑色的顆粒狀色素，常見于皮

14、膚色素細胞，惡性黑色素瘤。組織內(nèi)大量存在時呈棕黑色，易于鑒別。但量少時則需用特殊染色來顯示鑒別。黑色素不能為有機溶劑溶解，但易于用強氧化劑漂白而脫色。另外，黑色素本身具有還原銀液的能力。因此，用氨銀可以將組織中的黑色素顯示黑色。通過鐵反應(yīng)也可將其呈暗藍色而顯示出來。Fontana氏染色法：5%硝酸銀水溶液染色以0.2%氯化金水溶液增色 結(jié)果：黑色素呈黑色。六、酶類顯示酶的組織化學(xué)方法與其他組織化學(xué)方法不同，大都分組織化學(xué)方法是染色劑和組織成分的反應(yīng)， 反應(yīng)物直接來自于組織成分，如DNA、RNA、糖原等。而存在于組織細胞內(nèi)的各種酶，是通過一種間接的方法，顯示的是其活性，看不到酶本身。這種方法是在

15、一定條件下，將組織細胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解產(chǎn)物作為反應(yīng)物質(zhì)，再在原作用部位進行捕捉反應(yīng)物質(zhì)而顯色，所以我們看到的顏色實際上只是底物的顏色。在顯示酶的組織化學(xué)方法中，因顯示的是酶的活性，所以最大限度地保存組織中酶的活性是非常重要的。所選擇的方法既要保存好組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以保證酶在組織細胞中的準(zhǔn)確定位，又要保證酶不失活或丟失。影響因素:影響顯示酶的因素很多，歸納起來大致有以下幾種：（1）溫度：在酶反應(yīng)時。需要有一定的溫度。多數(shù)酶最適宜的反應(yīng)溫度是2037，過高的溫度會使酶蛋白變性、失活，酶的反應(yīng)速度增快；溫度過低酶反應(yīng)速度減慢，只適應(yīng)于酶活性強的組織。不過反應(yīng)溫度低時。酶定位較好

16、，不容易擴散。（2）pH：各種酶都有各自最佳的反應(yīng)pH值，在適宜的pH值內(nèi)，酶的活性最強，反應(yīng)速度最大，強酸、強堿都會便酶失活。（3）抑制劑和激活劑：能使酶活性降低的物質(zhì)為抑制劑，如某些金屬離子或氧化還原劑。能使酶活性增強的物質(zhì)為激活劑，如另一些金屬離子或其他基團等。（4）反應(yīng)底物的濃度：恒定的底物濃度也很重要，過高或者過低都會影響酶組織化學(xué)的反應(yīng)速度。常用的組織化學(xué)方法（1）金屬沉淀反應(yīng)法：特定的有色的金屬鹽與酶的分解產(chǎn)物結(jié)合、置換，通過金屬顯色來間接證明酶的存在。（2）偶聯(lián)偶氮法：萘酚系列化合物的底物在酶的作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素，顯示酶的定

17、位。這些底物多為人工合成。根據(jù)抑制酶的強弱可以分為同時偶聯(lián)法、后偶聯(lián)法。偶氮偶聯(lián)法目前被運用較廣。（3）色素形成法：底物的無色化學(xué)物質(zhì)在酶作用下，在作用局部形成色素沉著，而顯示酶的位置，如四唑鹽法、靛酚藍法、黑色素形成法、靛藍形成法、白色色素法等。（一）顯示堿性磷酸酶的 Gomori改良鈣-鈷法堿性磷酸酶（AKP）是組織化學(xué)最常研究的酶之一，分布廣泛，常見于轉(zhuǎn)運功能活躍的細胞膜上，又稱為膜酶。此酶在小動脈和毛細血管內(nèi)皮、肝毛細膽管膜、腎近曲小管刷狀緣、腸上皮紋狀緣等處最為豐富，再生組織細胞之內(nèi)也有。 堿性磷酸酶在堿性環(huán)境下催化水解磷酸單脂生成磷酸和醇，屬于水解酶。激活劑有Mg2、Mn2及某些氨

18、基酸等，最適pH為9.2-9.4。抑制劑有砷酸鹽、碘液、氰化物。本方法選用Mg2離子為激活劑，在pH 9.2-9.4孵育時，底物-甘油磷酸鈉被水解為甘油和磷酸，磷酸立即為高濃度的鈣鹽所捕獲，磷酸與Ca2結(jié)合而形成磷酸鈣沉淀于酶活性部位，再經(jīng)硝酸鈷轉(zhuǎn)變成不溶的磷酸鈷，經(jīng)硫化氨處理后，磷酸鈷又變成黑色不溶的硫化鈷沉淀，而顯示堿性磷酸酶的活性部位。（二）顯示酸性磷酸酶的萘酚 AS-BI法酸性磷酸酶（ACP）在酸性環(huán)境下，催化水解磷酸單脂生成磷酸和醇，又稱為酸性磷酸單脂酶。酸性磷酸酶分布廣泛，在前列腺、肝、脾酸性磷酸酶最為豐富。前列腺含量最高，其次吞噬細胞含量也豐富。肝內(nèi)毛細膽管旁、Kupffer細胞

19、內(nèi)、腎小管細胞內(nèi)、空腸上皮刷狀緣、腎上腺都有酸性磷酸酶，主要位于溶酶體，又稱溶酶體酶。在組織退變、核酸和蛋白質(zhì)代謝活動增加時，酸性磷酸酶的活性均增加。它還參與脂類代謝、神經(jīng)傳導(dǎo)沖動等。溶酶體較為特殊，如溶酶體膜完整時，底物不易浸入，酸性磷酸酶活性微弱或無活性，只有經(jīng)過固定以后。溶酶體膜通透性明顯增加，底物得以進入溶酶體內(nèi)，酶的活性才被顯示出來。最適宜的pH為4.5一5.5。抑制劑為氰化物、酒石酸鹽、氟化物等。 顯示酸性磷酸酶的方法很多,最早是Gomori在1941年建立的鉛法。但是鉛法的缺點在于非特異鉛易沉淀，造成假陽性，并且核也著色。盡管經(jīng)過多次改良。但仍未克服上述缺點，所以現(xiàn)在很少使用該法

20、。而偶氮法中的六偶氮副品紅（作重氮鹽）能迅速與茶酚AS系列產(chǎn)生穩(wěn)定的不溶于水和有機溶劑的紅棕色顆粒，更好地顯示了酸性磷酸酶。（三）顯示膽堿酯酶的組織化學(xué)方法膽堿酯酶屬于特異性酯酶，分為膽堿酯酶(ChE）和乙酰膽堿酯酶（AChE）兩類。前者為假性膽堿酯酶，后者為真性膽堿酯酶。兩者均屬于神經(jīng)系統(tǒng)中羧基酯酶，但其化學(xué)性質(zhì)不同。 AChE 水解乙酰膽堿， 而ChE不能水解乙酰膽堿。ChE主要分布于血漿、胰腺、唾液腺內(nèi)，而AChE主要存在于神經(jīng)組織（神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)和運動終板處）、紅細胞處。AChE活性的強弱是神經(jīng)細胞性質(zhì)和功能的重要參考指標(biāo)，顯示此酶可作為膽堿能傳遞部位的標(biāo)志。在法醫(yī)檢案過程申，如疑有機磷

21、中毒時，可取新鮮尸體的肋間肌、膈肌的縱切面、空腸的橫切面做此酶的檢測。因為有機磷中毒可使該酶受抑制而活性下降。其方法如下(Karnovsky-Rools亞鐵氰化銅法)。反應(yīng)原理：AChE水解碘化乙酰硫代膽堿，釋放出硫代膽堿和乙酰，硫代膽堿中的疏基(-SH)把鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，后者與銅離子結(jié)合形成紅棕色至深棕色的亞鐵氰化銅沉淀在酶活性部位。（四）酸性醋酸萘酯酶染色法1、原理淋巴細胞內(nèi)含有許多種酶，如醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴細胞細胞亞群所含酶類及其含量各異，如淋巴母細胞富含ACP，而成熟的T淋巴細胞則顯示ANAE活性，因

22、此可利用化學(xué)反應(yīng)作檢測。T淋巴細胞漿內(nèi)含有的酸性醋酸萘酯酶(acid naphthyl acetate esterase，ANAE)，在弱酸性條件下，能使底物酸性醋酸萘酯水解成醋酸和萘酚，后者與六偶氮副品紅偶聯(lián)，生成不溶性的紅色沉淀物，沉積在T淋巴細胞胞漿內(nèi)酯酶所在的部位，經(jīng)甲基綠復(fù)染，反應(yīng)呈現(xiàn)單一或散在的顆?；虬邏K，顯棕紅色。B淋巴細胞則無此種反應(yīng)。因此ANAE染色法可作為鑒別T淋巴細胞的一種非特異性方法。此外，單核細胞、中性粒細胞、酸性粒細胞及血小板等也可呈現(xiàn)酯酶染色陽性反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)注意區(qū)分。2、方法 分離單個核細胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hanks液1ml，加入到含有2ml淋巴細胞分層液

23、(比重10770001)的離心管中，以2 000 r/min離心30min。洗滌后，加少量Hanks液，搖勻。 制片取上述細胞懸液1滴，加到潔凈玻片上，涂片，自然干燥。 固定和染色將制備的細胞涂片用25%戊二醛液4固定10min，流水沖洗，待干。將玻片置于反應(yīng)液內(nèi)，37孵育1h，取出用水沖洗，待干。 復(fù)染用甲基綠染色液染1min(或瞬時染色)，水洗，吹干。油浸鏡下觀察計數(shù)。 3、結(jié)果判定鏡檢時，首先要判定是否為淋巴細胞。淋巴細胞經(jīng)ANAE染色后，可區(qū)分為兩大類：一類淋巴細胞的胞漿內(nèi)不見呈色物質(zhì)，為ANAE陰性細胞；另一類在胞漿中出現(xiàn)棕紅色物質(zhì)，為ANAE陽性細胞。根據(jù)呈色物質(zhì)的形態(tài)和分布又分為

24、塊狀A(yù)NAE陽性淋巴細胞和點狀A(yù)NAE陽性淋巴細胞。ANAE陰性淋巴細胞呈黃綠色，胞漿內(nèi)無明顯著色顆粒。 4、注意事項 （1）不同質(zhì)量的試劑，尤其是偶氮染料對反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、鮮艷程度、顆粒粗細和定位清晰程度等影響很大，應(yīng)加注意。 （2）由于本反應(yīng)為酶化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)非常靈敏，各種條件應(yīng)嚴(yán)格掌握。尤其是試劑的pH值要求準(zhǔn)確，需用精密pH試紙或pH計測定。 （3）配制反應(yīng)液時，各溶液混合，必須邊搖邊緩慢加入，若滴入過快，可出現(xiàn)沉淀，影響染色結(jié)果。 （4）制片過程中，標(biāo)本要求盡快固定、干燥和沖洗。若時間過長，可影響酯酶活性。 （5）涂片插入染色缸時，要注意必須將標(biāo)本面與反應(yīng)液接觸，切勿將標(biāo)本面緊貼缸壁

25、，以免影響染色反應(yīng)。如片子較多，反應(yīng)液相對減少，會使陽性率減低。 染色后沖洗不宜過久，防止酶反應(yīng)產(chǎn)物的紅色消減，造成標(biāo)本觀察困難。（五）顯示琥珀酸脫氫酶（SDH）的MTT法琥珀酸脫氫酶（Succinatedehydrogenase，簡稱SDH），黃素酶類，是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，屬膜結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標(biāo)志酶。琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細胞，和線粒體膜牢固結(jié)合，是三羧酸循環(huán)中唯一與內(nèi)膜結(jié)合的酶，是脫氫酶中最重要的酶。琥珀酸脫氫酶活力測定方法目前主要有五種。1、原理：MTT法：MTT全稱3-(4

26、,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些

27、生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。2、MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。 MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/

28、ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉. 3、方法貼壁細胞（1）收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。 （2）5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，一般5-7個梯度,

29、每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況 （3）5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。 （4）每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 （5）終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 （6）每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 （7）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜） 懸浮細胞1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1106/ml，按次序?qū)⒀a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin g/ml，需預(yù)試尋找最佳D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l稀釋度(儲存液100，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5104cell/