液相色譜常見問題及其對策解析

1、歡迎參加島津液相色譜維修培訓(xùn)班北京辦事處海辦事處費電話 800-810-0439 400-650-0439維修部稅庫ttp:/色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分 色譜法(Chromatography)：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進行分離的技術(shù) 流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體 固定相：靜止不動的一相色譜定義液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用 氣相色譜：以氣體作為流動相的色譜

2、分離方法適用于沸點較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動相只起運載樣品分子的能力 液相色譜液相色譜流程圖輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理采用 “HPLC” 級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相的選擇水的選擇水的等級純化水蒸餾水去離子水波長 (nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1 專門的純水機或超純水機:理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。2 去離子水重蒸

3、；3 二次或三次重蒸水；4 采用類似家用的純水機；5 市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水； 不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)越高放置時間越短。 有機溶劑的選擇溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫有機溶劑的選擇甲醇 乙睛 正己烷分析純級和 HPLC 級溶劑的吸光度比較圖水 / 甲醇梯度ODS 柱鬼峰Gradient Curve總流速1 ml/min, 在10分鐘之內(nèi)甲醇比例由0升到100%，維持10分鐘溶 劑 等 級鬼峰的

4、出現(xiàn)緩沖液的選擇 選擇緩沖液的步驟 1 .確定最佳分離狀態(tài)時的流動相pH 2 .選擇具有與流動相的pH相近的pKa 的緩沖液 （即使?jié)舛认∫簿哂休^強能力的緩沖液） 3 .確認檢測波長下緩沖液是否有大的吸收 （在波長210nm附近進行檢測時，不能用醋酸和 檸檬酸的緩沖液）一些代表性弱酸的pKa pK1 pK2 pK3 醋酸 4.87 檸檬酸 3.13 4.76 6.40 磷酸 2.16 7.2 1 12.32緩沖液的選擇緩沖液的使用 使用前必須過濾 使用后一定要進行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、阻塞: 第二天接著用：用20%甲醇：80%水沖洗20-30分鐘 隔幾天再用：用甲醇：水沖洗后，再用純甲醇

5、沖洗易受到細菌和霉菌的影響 不能直接用有機溶劑沖洗流動相的過濾 濾膜類型： 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。 醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶劑。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑脫氣： 除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動流動相的脫氣脫氣的方法1. 超聲波脫氣法2. 減壓脫氣法3. 使用氟樹脂膜的減壓脫氣法使用氟樹脂膜的減壓脫氣法

6、氟樹脂膜真空室往送液泵真空泵控制器流動相梯度洗脫法梯度洗脫裝置：高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。梯度洗脫：優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度混合器低壓梯度比例閥 高壓梯度低壓梯度脫氣機高壓/低壓梯度系統(tǒng)梯度洗脫法的注意點溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）查看空白實驗的數(shù)據(jù)。遵守分析周期。（最初的分析

7、數(shù)據(jù)不采用）液相色譜流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器手動進樣器檢測器管線材料材料 不銹鋼 Teflon PEEK (聚醚酮)尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.管線材料不銹鋼 (可用于所有連接)能承受幾千 kg/cm2 壓力酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕 (尤其在pH小于2時)PEEK (可用于所有連接)能承受高達 250 kg/cm2壓力可在整個PH范圍(pH 1-14)內(nèi)使用 不適用于高溶解性溶劑如氯仿等Teflon (用于柱后阻

8、尼管、反應(yīng)管和排液管)化學(xué)惰性大能承受 5 kgf/cm2 壓力材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用520的稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗注意點：吸濾頭拆下時不必將塑料管剪斷吸濾頭 LC-10ADvp LC-10ATvp島津VP系列輸液泵LC-20AT島津LC-20A系列輸液泵LC-20ADCheck valves for Pump BCheck valves for Pump ALC-20AB輸液泵柱塞往復(fù)泵單向閥馬達和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10 -100uL柱塞往復(fù)泵優(yōu)點壓力脈動小易于更換溶劑缺點需要更換柱塞桿密封圈LC-10ATvp泵：串聯(lián)

9、 式往復(fù)泵LC-10ADvp泵：并聯(lián)式 往復(fù)泵液相色譜輸液泵液相色譜輸液泵單向閥結(jié)構(gòu)拋光面透明塑料墊片寶石球吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭流動相單向閥原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭輸液泵容易出問題的部件故障1：寶石球粘附于墊片表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通措施：1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負壓， 使寶石球與墊片分開 2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中， 用超聲波清洗單向閥輸液泵容易出問題的部件故障2：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超 聲波清洗單向閥故障：密封圈磨損而導(dǎo)致 密封不良現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或 漏夜措施

10、：更換密封圈注意點：1）更換前，新密封圈用異丙醇 浸泡15 min2）拆卸泵頭前，柱塞桿復(fù)位（PSET）柱塞密封圈流動相泵頭清洗管路柱塞桿密封圈輸液泵容易出問題的部件故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓 力偏高措施：5稀硝酸，超聲波清 洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力3kgf/cm2，則可能堵塞。線路過濾器排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相輸液泵容易出問題的部件進樣器自動進樣器手動進樣器 原理：（六通閥） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入手動進樣器的原理圖 裝填狀態(tài)進樣狀態(tài)進樣器進樣量和檢測器響應(yīng)的關(guān)系示意圖進樣體積 檢測器響應(yīng)值定量環(huán)體積的一半3倍定量環(huán)

11、體積全量注入部分注入部分注入和全量注入部分注入：一般要求進樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如20l的定量環(huán)最多進樣10l的樣品，并且要求每次進樣體積準確、相同全量注入：進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性。交叉污染的原因便捷的方法（不需清洗） 1.進樣狀態(tài)下插入微量注射器 2.切到裝填狀態(tài) 3.注入樣品 4.切回到進樣狀態(tài)手動進樣法1）進樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭 進樣針2）進樣時，進樣針應(yīng)插到底3）轉(zhuǎn)動手柄時應(yīng)盡快，不要停留在中途4）不使用時將針頭留在進樣器內(nèi)5）樣品溶液pH小于10, 常

12、用密封墊的材質(zhì)適用pH10, 否則換特氟隆材質(zhì)的密封墊pH10-136）分析結(jié)束后沖洗進樣口，清洗應(yīng)使用專用針口清洗器手動進樣器定子轉(zhuǎn)子塑料箍彈簧不銹鋼套手動進樣器操作注意點清洗針口手動進樣閥 故障：轉(zhuǎn)子密封損壞 現(xiàn)象：漏液 原因：a 擰的太緊 b 樣品太臟 c 針頭損壞或不使用液相專用針 解決措施：更換轉(zhuǎn)子密封手動進樣閥容易出問題的部件手動進樣閥容易出問題的部件手動進樣閥 故障：載樣困難 原因：a 定量環(huán)堵塞 b 進樣器污染 解決措施：清洗或更換定量環(huán)、進樣器柱溫箱的作用分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性 硅膠基底聚合物基底pH 范圍2 - 7.5寬范圍有機溶劑所有有限制壓力 2

13、50 kgf/cm2低壓溫度寬范圍60C色譜柱的類型及適用范圍液相色譜柱在使用新柱之前，最好用強溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 mins，長時間未用的分析柱也要同樣處理定期使用強溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時，要先用水沖洗，再用有機溶劑沖洗4、凈化樣品，使用預(yù)柱5、分離條件6、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干枯7、避免流動相組成及極性的劇烈變化8、避免壓力脈沖的劇烈變化液相色譜 柱的維護柱壓低于150kgf/cm2柱溫在40左右，最高使用溫度為50緩沖液PH使用范圍為27.5流動相有機溶劑比例過低, 柱效下降快硅膠在PH為34時穩(wěn)定性最好堿濃度越低，流動相含水量越低

14、，硅膠越穩(wěn)定。ODS柱的使用注意點：液相色譜柱的維護色譜柱的故障濾片或填料堵塞樣品或流動相中雜質(zhì)吸附機械振動產(chǎn)生空隙填料變性濾片或填料堵塞使用預(yù)柱緩沖液和溶劑使用0.45um濾膜過濾樣品溶液使用0.45um濾膜過濾反向連接色譜柱，使用清洗溶劑以小流量送液打開柱頭，清洗或更換濾片樣品或流動相中雜質(zhì)吸附雜質(zhì)會產(chǎn)生拖尾峰僅 1 cm深度會被污染色譜柱取出污染填料，裝填新的填料柱的補修填料的取出柱的補修恢復(fù)例柱的補修機械振動產(chǎn)生空隙不要撞擊色譜柱如 色譜柱掉落或柱壓急劇變化 。8945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx000 0000 0LC-10A

15、D :輸液時不要打開排液閥Back反相色譜分析時添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制堿性化合物色譜峰拖尾添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾三乙胺(triethylamine) 也用于正相色譜中,使硅膠部分去活性, 以獲得化合物合適的保留時間注意事項紫外可見檢測器原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，AKCL優(yōu)點：1）對溫度和流速變化不敏感 2）可用于梯度分析缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)紫外可見檢測器樣品池參比池光電管光電管EinEinEin光柵D2 / W 燈lEout紫外可見檢測

16、器參比池樣品池光線光電倍增管紫外可見檢測器島津VP系列紫外檢測器功能1）設(shè)定時間程序（波長切換等）2）雙波長檢測3）比例色譜，初步判斷峰的純度4）停泵掃描，確定組分最大吸收波長波長切換雙波長檢測比例色譜280nm220 nmratio280/220波長掃描更換氘燈（紫外檢測器） 判斷氘燈能量： 設(shè)定220nm波長，檢查參比池能量，如 能量低于800，需更換氘燈。 操作注意點： 不要用手直接接觸氘燈表面紫外檢測器容易出問題的部件紫外檢測器容易出問題的部件故障：樣品池受污表現(xiàn)：樣品池和參比池能量相差較大檢查方法：設(shè)定250nm波長，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如兩者相差較大，則

17、樣品池受污。措施：用針筒注入異丙醇，清洗樣品池；如污染嚴重， 拆開樣品池，將透鏡等放入異丙醇中超聲波清洗。液相色譜流程圖輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理液相色譜常見問題及其對策液相色譜常見問題類型 A. 壓力異常（偏高、波動） B. 漏液 C. 保留時間漂移 D. 基線問題（漂移、噪聲） E. 峰形異?，F(xiàn)象：無壓力，流動相不流動可能原因 1、保險絲斷或電源問題 2、柱塞桿折斷 3、泵頭內(nèi)有空氣或流動相不足 4、單向閥損壞 5、漏液 6、壓力傳感器損壞(流動相流動正常，但無壓力)壓力異常現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升 1、流速設(shè)定過高 2、保護柱或柱子篩板堵塞 3、流動相使用不當或有緩沖

18、鹽析出 4、色譜柱選擇不當 5、進樣閥損壞 6、線路過濾器堵塞壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低 1、流速設(shè)定過低 2、色譜柱選擇不當 3、柱溫過高 4、系統(tǒng)漏液壓力異常壓力異?，F(xiàn)象：壓力波動可能原因 1、泵頭中有氣泡 2、單向閥損壞 3、柱塞密封圈損壞 4、脫氣不充分 5、系統(tǒng)漏液 6、使用了梯度洗脫漏液接頭處漏液 1、接頭處松動 2、接頭磨損 3、接頭被污染 4、部件不匹配 漏液泵漏液 1、單向閥松動 2、泵密封損壞 3、放空閥損壞 4、接頭松動（不要擰的太緊）進樣閥漏液 可能原因 1、轉(zhuǎn)子密封損壞 2、定量環(huán)堵塞 3、進樣口密封松動 4、進樣針尺寸不合適 5、廢液管產(chǎn)生虹吸 6、廢液管堵塞漏液檢測器漏液 可能原因 1、流通池墊片損壞 2、流通池透鏡破碎 3、手緊接頭處漏液 4、廢液管堵塞 5、流通池堵塞漏液保留時間漂移 可能原因 1、柱溫變化 2、流動相組分變化 3、色譜柱沒有平衡 4、流速變化 5、泵中有氣泡 6、流動相選擇不當 7、鍵合相流失 8、緩沖容量不夠保留時間漂移基線漂移 可能原因 1、溫度波動 2、流動相不均勻(脫氣，使