15種蛋白質(zhì)單晶培養(yǎng)的方法

1、15 種蛋白質(zhì)單晶培養(yǎng)的方法：大量養(yǎng)晶法(bulk crystallization):若急著養(yǎng)出單晶，則將純化之蛋 白質(zhì)溶液加入固體鹽類或飽和鹽液，直到溶液中出現(xiàn)乳白混濁色，離心后把上清 液(supperna tan t)放置數(shù)天至數(shù)周，有可能養(yǎng)出單晶。批次養(yǎng)晶法(batchmethod):若發(fā)現(xiàn)加入蛋白質(zhì)的沉淀劑和鹽類等化學(xué)藥 品，在濃度C1產(chǎn)生沉淀，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細(xì)分成一串濃度 ClC2C3.CiCn,(n-2)個小試管進(jìn)行養(yǎng)晶，可能結(jié)出單晶。此法之主要 缺點在于蛋白質(zhì)的消耗量大。大量透析法(bulk dialysis):把蛋白質(zhì)溶液包在半透膜(nembrane)內(nèi)，

2、浸入盛有化學(xué)藥品的器皿中，半透膜能讓小分子進(jìn)出，卻不會讓蛋白質(zhì)等大分子 通過，則器皿中沉淀劑、鹽類和有機溶液等化學(xué)藥品會穿過半透膜，與蛋白質(zhì)起 作用，直到膜之內(nèi)外的濃度梯度(concentrationgradient)降到零為止。此法 的好處在于，器皿中化學(xué)藥品之濃度可作連續(xù)之調(diào)整， pH 值的范圍也可探討。 壞處是膜之內(nèi)外濃度差異減少時，平衡速率也隨之降低。微量透析法(microdialysis):把半透膜的體積縮小，綁在比鈕扣略大的 襯架上，架體之凹槽內(nèi)注入蛋白質(zhì)溶液，包覆半透膜的體架放入盛有化學(xué)藥品的 器皿，其養(yǎng)晶原理與大量透析法相同，只是使用蛋白質(zhì)和化學(xué)藥品的量放得少。 注意凹槽內(nèi)不得

3、留有氣泡，否則膜外的化學(xué)藥品為氣泡所阻止而無法透過氣泡， 滲入膜內(nèi)的蛋白質(zhì)溶液。連續(xù)萃取(sequen tial ext rac ti on)：此法所根據(jù)的原理是亞可比(Jacoby) 的實驗，他發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4T以下 取得上清液(superna tant),放在室溫長晶。先將蛋白質(zhì)溶液加入固體硫酸銨 或飽和硫酸銨液體，使蛋白質(zhì)溶液沉淀，離心除去上清液。接著保持4C以下處 理一系列的蛋白質(zhì)沉淀物。準(zhǔn)備數(shù)種依次遞降濃度的沉淀劑(通常為蒸餾水)， 濃度高的沉淀劑先加入上述蛋白質(zhì)沉淀物中，以玻棒攪拌并離心，取出上清液， 放在室溫養(yǎng)晶，再把濃度次高的沉淀劑加入上次

4、未完全溶解的蛋白質(zhì)沉淀物，攪 拌離心，把上清液置于室溫養(yǎng)晶，依次類推，直到蛋白質(zhì)全部溶解為止。這樣每 次取出的蛋白質(zhì)濃度依次遞減，溶液由低溫移至高溫，符合亞可比的準(zhǔn)則，可能 養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶。自由接口間的擴(kuò)散法(free interface diffusion):若蛋白質(zhì)在不同的 溶劑中具有不同的溶解度，則蛋白質(zhì)注入盛有沉淀劑試管的上方或下方(依密度 而定，密度大者放在下方)，在兩種溶液的交界面擴(kuò)散會有晶核長出，裝置如圖 7-10 所示。凹盤或玻片上的蒸汽擴(kuò)散法(vapor diffusion on plates or slide 座滴法:蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的要領(lǐng)在于蛋白質(zhì)達(dá)成過飽和溶液，同時添加的化學(xué)

5、藥物與 蛋白質(zhì)起作用，協(xié)助晶核的形成。摻有化學(xué)藥品的蛋白質(zhì)溶液，其水分慢慢擴(kuò)散， 達(dá)到過飽和溶液則有可能長出單晶。若蛋白質(zhì)溶液暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉， 則蛋白質(zhì)干涸，無法形成單晶，原因是蛋白質(zhì)單晶約略維持液態(tài)的結(jié)構(gòu)，含有大 量水分，水分與蛋白質(zhì)間形成許多氫鍵，水分蒸發(fā)，蛋白質(zhì)也無以為系，因此必 須保持水分，使蛋白質(zhì)溶液密閉在一個容器中。同時還得調(diào)節(jié)水分，所以必須置 放兩種溶液，使蛋白質(zhì)溶液中的水分?jǐn)U散到另一種高濃度的溶液中，以達(dá)蛋白質(zhì) 溶液的過飽和。通常選擇適當(dāng)?shù)柠}類和有機溶劑，調(diào)在等電點的 pH 值，形成沉 淀劑，把粉晶蛋白質(zhì)泡成一定濃度，約在540mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍 硅，注

6、入一些蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑總共1040 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒 入2030ml的沉淀劑。在塑料的四周涂真空油膏(Vacuum grease),加以密圭寸。 通常這樣的塑料盒對于每種養(yǎng)晶條件制備兩盒，一盒放在4C的低溫，另盒放在 室溫，待其長晶，快則一周，慢則數(shù)月，幸運的話，可望長出單晶。通常一次制 備數(shù)拾條件，大量養(yǎng)晶。要鑒定長出的單晶確實是蛋白質(zhì)而不是滴入的沉淀劑等 化學(xué)藥品。若養(yǎng)出蛋白質(zhì)單晶太小，不足以供X光繞射實驗使用，則可使用連續(xù) 播種法把小晶粒養(yǎng)大：依照養(yǎng)出蛋白質(zhì)小單晶的條件，炮制母液(蛋白質(zhì)溶液配 合沉淀劑)，注入凹孔，外圍倒注沉淀劑，加以密封，等待約半天后，打開封蓋， 把以

7、前所養(yǎng)的小晶粒稍加清洗后放入，企圖長大，若長出的晶體仍然不符X光使 用，則把最后一次的晶體當(dāng)新晶種，再繼續(xù)播種，直到晶體夠大。此種養(yǎng)晶法的 好處是：用量少，篩選多種條件相當(dāng)理想;易于修飾塑料盒內(nèi)沉淀劑的濃度。此 種養(yǎng)晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液， 另一凹孔注入2040m l的沉淀劑，以小玻片密封，等待長晶。懸滴液蒸汽擴(kuò)散法(vapor diffusion in hanging drops) 一懸滴法：它 在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽達(dá)到平衡，利用少量蛋白質(zhì)篩選多種養(yǎng)晶條件。 此法用量比座滴液更少。在方形或圓形的玻片上鍍硅，滴入少于10ml的蛋白質(zhì) 母液

8、，在培養(yǎng)皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀劑，把方形玻片翻轉(zhuǎn)，蓋在凹槽 孔緣，加以密封，形成懸滴液，進(jìn)行擴(kuò)散，蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，長出單晶。液體橋連法(liquid bridge)如圖7T2(b)所示，一小滴母液和一滴沉淀 液分別滴在玻璃片的兩靠近處，以細(xì)針引導(dǎo)細(xì)橋相接，把此載有液滴的玻片放在 密圭寸容器中，在細(xì)橋相連處可望長出單晶。(10)濃度透析法(concentration dialysis):，離子強度弱，則蛋白質(zhì)溶解度低，易形成晶核，長出單晶，可利 用氮氣在裝有蛋白質(zhì)和鹽類的透析袋內(nèi)施壓，使鹽類穿透透析膜流出，降低袋內(nèi) 鹽類濃度，使蛋白質(zhì)溶液在低離子強度下長出單晶。pH引導(dǎo)長晶法(c

9、rystallization induced by pH):蛋白質(zhì)的溶解度在等 電點的pH值最低，是個良好的養(yǎng)晶條件。有些蛋白質(zhì)在不同的數(shù)個pH值，具有 數(shù)個溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的 pH 值是個好辦法。也可在蒸汽擴(kuò)散法中，在外圍滴入揮發(fā)性酸或堿(如氨水或 干冰等)來調(diào)節(jié) pH 值。溫度長晶法(temperature crystallization):蛋白質(zhì)溶解度為溫度的 函數(shù)，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序，引起能趨 疲(熵)(entropy)的降低。由液體轉(zhuǎn)變到固體，其熵會降低，反之亦然。井 然有序排列的分子易于長晶。通常一種長晶條件泡兩份，一份置于室溫，另一份 放在4C的冰箱。蒸發(fā)(evaporation):這是最原始的方法，為小分子的長晶常用法，也 是某些蛋白質(zhì)常用的養(yǎng)晶法。在蛋白質(zhì)不變性的條件下，慢慢讓母液蒸發(fā)，使蛋 白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和，結(jié)出單晶。填加有效分子法(effector addition):與有效分子(effector)結(jié)合 的蛋白質(zhì)，其溶解度往往與無有效分子結(jié)合者差異大，可達(dá)到某些構(gòu)象(conformation)平衡狀態(tài)的存在，養(yǎng)出此種構(gòu)象單晶，通常的有效分子有配位 體(ligand)和基質(zhì)(substrate)等。對蒸餾水透析法(dialysis against wat