分子生物學(xué)技術(shù)-第五章 核酸擴(kuò)增技術(shù)

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1核酸擴(kuò)增技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù) 第五章2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2主要內(nèi)容第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)第二節(jié) 熒光定量PCR技術(shù)第三節(jié) 其他核酸擴(kuò)增技術(shù)第四節(jié) 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理與 質(zhì)量控制2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)

2、生物技術(shù)（即細(xì)胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴(kuò)增技術(shù)）之一。 由于通過體外（試管內(nèi)）擴(kuò)增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達(dá)到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達(dá)到一個(gè)細(xì)胞、甚至一個(gè)分子的水平。 第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4一、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理Watson、Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Meselson、Stahl:半保留復(fù)制模型。Khorana：最早提出體外擴(kuò)增核酸的設(shè)想Kary. B. Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)Saiki：

3、發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶（一）PCR技術(shù)發(fā)展簡史2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。 他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作， 卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA 的想法.很少有在公司工作的科研人員得諾貝爾獎(jiǎng)， Mullis是其中之一2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical

4、Genetics6Kary B. Mullis（1944）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics7Mullis開車的時(shí)候, 瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA， 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics8引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneti

5、cs99455372022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1094變性50-65退火XX延伸2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics11Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。2022/10/10Zheji

6、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics12PCR不只是一個(gè)方法改進(jìn)Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴(kuò)增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費(fèi)將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠(yuǎn)。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics13生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基

7、因定點(diǎn)突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究基因表達(dá)量研究（real-time PCR） / 基因表達(dá)譜研究（ DNA chip, SAGE）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics14PCR儀器的變遷三個(gè)水浴鍋， 用手移動(dòng) （Mullis等人當(dāng)時(shí)用的）電加熱塊 自來水冷卻 （PE，1988）電加熱塊 內(nèi)置循環(huán)液冷卻 （PE，1989）三個(gè)加熱塊 機(jī)械手 （Stratagene，1994）半導(dǎo)體制冷和加熱 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）溫度梯度, 熒光檢測

8、(如 Roche的Lightcycler)風(fēng)加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個(gè)水浴鍋+機(jī)械手的原始PCR儀（華美，復(fù)日等）現(xiàn)在以半導(dǎo)體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈, 廈門安普利等）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics15 PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。 （二）PCR技術(shù)基本原理2022/10/10Zhejiang P

9、rovincial Key Lab of Medical Genetics16PCR 循環(huán) 第一步 加熱變性2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics17PCR 循環(huán)- 第二步 引物與模板DNA分子退火Primer 1Primer 2535535332022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics18PCR 循環(huán)- 第三步 - 引物延伸Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase2022/10/10Zhejiang Pr

10、ovincial Key Lab of Medical Genetics19第1個(gè) PCR 循環(huán)完成后 得到兩個(gè)拷貝的靶序列2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)數(shù) 擴(kuò)增產(chǎn)物量 （2n）121222243238424165253262664202201,048,576302301,073,741,8242022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics21模板DNA94變性55退火72引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)

11、25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics221234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics23PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（mi

12、n）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA942022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics24PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9555引物1引物2DNA引物2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics25PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶20

13、22/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics26PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束94第2輪開始2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics27PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)945572TaqTaqTaqTaq2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics28PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束2022/10/

14、10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics29PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics30在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步, 模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個(gè)循環(huán)需24min， 23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。2022/10/10Zhejiang

15、Provincial Key Lab of Medical Genetics31nyny圖6-2-1 圖6-2-2PCR擴(kuò)增效率圖（三）PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 到達(dá)平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics32反應(yīng)組成（五要素）：模板（template）引物（ primer ）DNA 聚合酶（ DNA polymerase ）dNTPPCR buffer 二、PCR反應(yīng)體系及其優(yōu)化（一）PCR反應(yīng)動(dòng)體系2022/10/10Zhejiang Provincial Key

16、 Lab of Medical Genetics331. 模板（template）DNA RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA模板就是待擴(kuò)增的目的基因或其特異片段（靶序列） 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics34預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異。偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。量：0.1-0.5umol/L2. 引物（primers)引物（primers）是人工合成的一對可以分別與兩條模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序

17、列 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics35引物設(shè)計(jì)要求：引物長度 分布的均衡性引物二聚體及二級結(jié)構(gòu)引物3端、5端的特異性引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics36引物的長度：1530核苷酸，引物過短會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性，引物過長會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，增加退火難度。引物的均衡性：引物中堿基組成應(yīng)盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，兩條引物應(yīng)該有匹配的GC含量，GC含量一般40%60

18、%。引物的二級結(jié)構(gòu)：應(yīng)避免由于引物分子之間存在較多的互補(bǔ)堿基而形成引物二聚體。 引物設(shè)計(jì)原則2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics37引物的末端：引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸。引物的5末端堿基無嚴(yán)格限制，5末端可以被修飾。 引物的特異性：引物與非目的基因序列的同源性不超過70%，3末端不要有連續(xù)8個(gè)堿基與非目的基因序列同源。 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics38

19、量：0.5-5u /100ul 偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增 偏低：產(chǎn)物量降低特性：(耐高熱)熱穩(wěn)定性:92.5、95、97.5時(shí)，半衰期分別為130min、40min、5-6min延伸效率:75-80時(shí)，150個(gè)核苷酸/s 校正功能:Taq DNA聚合酶沒有3-5外切酶活性，Vent 、pfu等具有3-5外切酶活性3. DNA 聚合酶(DNA polymerase)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics39 dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：50-200umol/L過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿

20、基的錯(cuò)誤摻入率和室驗(yàn)成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性 dNTP會(huì)絡(luò)合Mg2+，當(dāng)PCR需要較高濃度的dNTP時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)體系中適當(dāng)增加Mg2+濃度。 。4. dNTP2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics40一般組成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室溫pH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl 促進(jìn)引物退火，濃度過高抑制Taq DNA聚合酶的活性。Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH，使反應(yīng)體系偏堿性，發(fā)揮Taq DNA聚合酶活性。Mg2+濃度：影響 Taq DNA聚合酶活性Mg2+濃度過高，反

21、應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 PCR促進(jìn)劑：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）5. PCR緩沖液（PCR buffer）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4150 ul PCR反應(yīng)體系的組成樣品DNA 0.11ug；正鏈引物（25umol/L）1.0ul；負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；10PCR緩沖液 5.0ul；MgCl2（25mmo

22、l/L）3.0ul；Taq DNA聚合酶12.5u；蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。6. PCR一般方案2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics42PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置 94 3060sec， 55 3060sec， 72 3060sec， 循環(huán)30次，最后72延伸5min。PCR產(chǎn)物的保存與檢測 PCR產(chǎn)物于4保存，PCR產(chǎn)物檢測。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4

23、3模板引物緩沖液Mg2+三磷酸脫氧核苷酸耐熱DNA聚合酶溫度循環(huán)參數(shù) 變性、復(fù)性、延伸的溫度與時(shí)間 循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率：循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增程度。（二）PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics44起始模板數(shù)量與足量產(chǎn)物的熱循環(huán)次數(shù)起始模板DNA分子數(shù) 循環(huán)次數(shù) 5040-451.010335-401.510430-353.0105 25-30 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics45剃度PCR（TD PCRTouch-down P

24、CR） 根據(jù)引物Tm值，選定一個(gè)退火溫度范圍（跨越1020的溫度范圍，引物Tm值在這個(gè)范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時(shí)，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低15），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個(gè)退火溫度上循環(huán)25次。熱啟動(dòng)PCR（hot start PCR） 由于Taq DNA聚合酶在低溫時(shí)仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應(yīng)前的升溫過程中會(huì)出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應(yīng)的特異性。可以通過所謂的“熱啟動(dòng)”方式克服這一問題。兩種優(yōu)化參數(shù)的PCR技術(shù)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

25、46(一) 凝膠電泳 1瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電操作方法簡單，能對PCR產(chǎn)物的長度進(jìn)行粗略的鑒定，是應(yīng)用最廣泛的檢測PCR產(chǎn)物的方法。在電泳過程中，凝膠中的溴化乙錠(EB)嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光。該法缺點(diǎn)是不能鑒定PCR產(chǎn)物的序列，而且存在溴乙錠污染。 三、 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測與分析PCR產(chǎn)物是否為目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，還是非特異擴(kuò)增？2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics47 瓊脂糖濃度與分離線狀DNA的有效范圍瓊脂糖含量(%) 分離線狀DNA的有效范圍(kb) 0.51-3

26、0 0.70.8-12 1.00.5-10 1.20.4-7 1.50.2-3 2.00.1-22022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics48 2聚丙烯酰胺凝膠電泳法特點(diǎn)：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，且避免EB易退色的弱點(diǎn)。用途：PCR擴(kuò)增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/10/10Zhejiang Provincial Key La

27、b of Medical Genetics49 丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍丙烯酰胺(%) 有效分離范圍(bp) 溴酚藍(lán)位置(bp) 二甲苯藍(lán)位置(bp) 3.51000-2000 1004605.080-500 652608.060-400 4510012.040-200 207015.025-150 156020.05-100 12452022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics50不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有特異的DNA識別序列，突變堿基的出現(xiàn)有可能會(huì)改變限制酶的識別位點(diǎn)，使切點(diǎn)增多或減少，導(dǎo)致酶切片段的數(shù)量或

28、大小發(fā)生改變。 PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）（二）PCR產(chǎn)物的酶切分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics51PCR-RFLP法： 惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因限制性內(nèi)切酶突變限制性內(nèi)切酶2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics521點(diǎn)雜交（dot blot）2

29、反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot）3微孔板雜交（microplate hybridization）4PCR-EIA：（RNA probe hybridization enzyme immunoassay, RPEIA）5Southern印跡雜交（Southern blot）（三）核酸探針雜交分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics531假陽性PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。陽性對照的污染。標(biāo)本之間的交叉污染。在采集標(biāo)本時(shí)，其他污染源帶來的污染。Taq聚合酶中帶有細(xì)菌DNA，當(dāng)PC

30、R擴(kuò)增片段為保守的rRNA序列時(shí)，易造成假陽性。四、常見問題原因分析與處理2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics542假陰性(1) 標(biāo)本處理的原因 處理標(biāo)本時(shí)，靶DNA丟失。處理標(biāo)本時(shí)，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應(yīng)中抑制了Taq酶活性。標(biāo)本放置不當(dāng)，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics55(2) PCR試劑問題 Taq DNA聚合酶失活。Mg2+濃度過低或是沒有加。(3) PCR擴(kuò)增過程中的問題PCR擴(kuò)增

31、儀故障。PCR擴(kuò)增反應(yīng)液沒有加液體石蠟油。(4) PCR產(chǎn)物鑒定中的問題電泳時(shí)沒有加溴化乙錠。電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。凝膠濃度過低，使擴(kuò)增帶跑散。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics563引物二聚體 兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補(bǔ)區(qū)。 引物模板比例太高，可增加模板用量。 退火溫度過低。 熱循環(huán)次數(shù)過多。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics574非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因提高

32、PCR反應(yīng)特異性的辦法 5PCR污染及預(yù)防措施標(biāo)本、操作人員、實(shí)驗(yàn)室的一切試劑、器材及儀器 6RNA酶的污染與預(yù)防（ RT-PCR ）（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics58巢式PCR（nested PCR ） 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR（multiplex PCR ） 重組PCR（recombinant PCR ） 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對稱PCR（asym

33、metric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)定量PCR 五、PCR衍生技術(shù)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics59巢式PCR外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次 PCR第二次 PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics60逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增2022/10/10Zhejiang Provinc

34、ial Key Lab of Medical Genetics61用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物多重PCRPCR產(chǎn)物2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics62引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，變性和復(fù)性延伸異源部分雙鏈DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533重組PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics63AgAb生物素化的DNAAg-Ab復(fù)合物DNA-連接分子復(fù)合物連

35、接分子檢測PCRAg-Ab-連接分子-DNA-復(fù)合物免疫PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics64原位PCR（in situ PCR） 原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。 基本過程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對組織或細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以確保PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，最后對DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位擴(kuò)增。然后進(jìn)行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical G

36、enetics65定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）廣義概念上的定量PCR是指通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板進(jìn)行定量的技術(shù)。 指數(shù)擴(kuò)增期2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics66第二節(jié)熒光定量PCR技術(shù)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics67實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線

37、對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics68常 規(guī) PCR技術(shù)： 對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics692022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of

38、 Medical Genetics70定量原理介紹三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics71擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics722022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medic

39、al Genetics73熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍真正的信號:熒光信號超過域值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics74Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循

40、環(huán)次數(shù)C(t) value 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics75實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 標(biāo)準(zhǔn)曲線 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics76確定未知樣品的 C(t)值 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 絕對定量

41、252022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics77熒光定量PCR（FQ-PCR）基于熒光能量傳遞技術(shù)（Fluorescence resonance energy transfer FRET）,通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán), 轉(zhuǎn)移效率與兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度。在PCR反應(yīng)體系中，F(xiàn)Q-PCR的熒光標(biāo)記物可分為兩種：熒光染料標(biāo)記和熒光探針標(biāo)記。2022/10/10Zheji

42、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics78一、熒光染料法 SYBR熒光染料 能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 此方法未使用目的特異性探針，其特異性完全由引物決定。在有非特異雙鏈DNA產(chǎn)生時(shí)，其熒光也同樣增強(qiáng)，此法與常規(guī)PCR的特異性差別不大。 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics79 SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 只有和

43、雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR Green 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics80圖6-10 SYBR-Green I熒光染料原理示意圖53激發(fā)53SG發(fā)射SGSGSGSG5353激發(fā)SGSGSG發(fā)射SGSG不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)出任何熒光信號 SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈,發(fā)出熒光信號2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Med

44、ical Genetics81SYBR Green 法優(yōu)缺點(diǎn) 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNA 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜優(yōu) 點(diǎn) 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性,但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件 對引物特異性要求較高缺 點(diǎn)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics821Taqman技術(shù) 二、熒光探針法與目標(biāo)序列互補(bǔ) 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無

45、熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics83TaqMan技術(shù)原理示意圖3端的熒光Q分子吸收5端熒光R分子的熒光信號 探針5端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來 熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例 5353QRQ53R53激發(fā)5353激發(fā)RQ引物Taq 酶2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics84TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn) 對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定 設(shè)計(jì)

46、相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu) 點(diǎn) 只適合一個(gè)特定的目標(biāo) 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics85在Taqman探針的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了一系列的技術(shù)進(jìn)展。雙探針技術(shù)的特點(diǎn)是將熒光分子和淬滅分子分別標(biāo)記在兩個(gè)不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針。雜交時(shí)兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成正比，以此可進(jìn)行PCR定量分析。最近廣泛應(yīng)用的另外一個(gè)新技術(shù)就是TaqMan-小溝結(jié)合物（minor groove

47、 binder，MGB）探針。 Taqman技術(shù)的延伸2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics86雙探針技術(shù)原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比 RQXQ 淬滅探針 R 發(fā)光探針2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics87TaqMan-MGB探針示意圖 MGB:Minor Groove Binder(Tm enhancer)MGBQRMGB探針的3端采用了非熒光性的淬滅基因淬滅基團(tuán)吸收報(bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。M

48、GB探針的3端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm 值，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm 值而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics88亦稱分子燈塔法，是一段熒光標(biāo)記的單鏈寡核苷酸探針，其鏈由兩部分組成，一部分是能與靶基因堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列，是檢測靶基因的部分，位于探針的中間位置，探針形成后構(gòu)成探針的環(huán)部，另一部分是分別在5和3端的熒光標(biāo)記物質(zhì)和熒光淬滅劑。5和3端有幾個(gè)互補(bǔ)的堿基存在，因而可形成兩端

49、反轉(zhuǎn)配對，構(gòu)成探針的莖部。在游離狀態(tài)下，分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導(dǎo)致熒光淬滅，此時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子燈塔發(fā)出的熒光檢測不到。2Molecularbeacon技術(shù)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics89RQX激發(fā)RQQR激發(fā)發(fā)射分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導(dǎo)致熒光淬滅 單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交探針5和3端分離,淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光 Molecularbeacon技術(shù) 原理示意圖2022/10/10Zhejiang Provinc

50、ial Key Lab of Medical Genetics90該法的基本原理是首先合成兩個(gè)探針，一是熒光探針（25bp），5端接一熒光分子，另一為淬滅探針（15bp），3端接一淬滅分子，淬滅探針能與熒光探針5端雜交。當(dāng)兩探針結(jié)合時(shí)，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，溶液中沒有熒光產(chǎn)生，但兩探針分離時(shí)，熒光探針發(fā)出的熒光不再被淬滅探針吸收，溶液中即可檢測到熒光。當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)溶液中無模板時(shí)，兩種探針特異性結(jié)合，溶液中無熒光產(chǎn)生；當(dāng)溶液中有模板時(shí)，在較高溫度下熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合，從而使兩探針分離產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與溶液中模板數(shù)量成正比，因此，可進(jìn)行PCR定量。3復(fù)合探針法2022/10/1

51、0Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics91Q淬 滅 XQ 淬滅探針 R 發(fā)光探針RR復(fù)合探針法原理示意圖2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics92四、FQ-PCR的應(yīng)用前景 三、FQ-PCR測定的數(shù)據(jù)處理 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics93第三節(jié)、其他核酸擴(kuò)增技術(shù)（一）核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）核酸序列依賴性擴(kuò)增，又稱自