體內(nèi)藥物分析 生物樣品與樣品制備

1、第一節(jié) 生物樣品的種類、采集、制備 與貯存一、生物樣品的種類、采集和制備第三章 生物樣品與樣品制備1 體內(nèi)藥物分析采用的生物樣品包括各種體液和組織，常用的是血液血漿、血清、全血、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等樣品。 其中最常用的是血漿或血清，因?yàn)樗鼈兛梢暂^好地表達(dá)藥物濃度和治療之間的關(guān)系。2一血液1. 血樣的采集 供測(cè)定的血樣應(yīng)能代表整個(gè)血藥濃度，因而應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動(dòng)脈或心臟取血。 對(duì)于病人，通常采取靜脈血。 當(dāng)血藥濃度高和分析方法靈敏時(shí)，也可從毛細(xì)管手指、耳垂、腳趾采少量血。 3 測(cè)定血中藥物濃度

2、，通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。 一般認(rèn)為，當(dāng)藥物在體內(nèi)到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度與藥物在作用點(diǎn)的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)靶器官的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。4藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定中常用的取樣次數(shù)見(jiàn)示意圖： 5 1血漿(plasma)的制備： 血液置含有抗凝劑如：肝素、草酸鹽等的試管中，混合后，離心，別離血細(xì)胞，淡黃色上清液即為血漿。 肝素是一種含硫酸的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白。一般1ml的全血需加0.10.2mg的肝素。參加血樣后立即輕輕

3、旋搖，但勿太猛烈，以免導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。6(2)血清的制備 采集的靜脈血液置試管中，放置30 min到1 h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白，血液逐漸凝固，離心后上層澄清的淡黃色液體即為血清。7 血漿比血清別離快，而且制取的量約為全血的50%60%血清只有30% 40%，多數(shù)研究者喜用血漿進(jìn)行分析測(cè)定。假設(shè)血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物的測(cè)定有影響，那么應(yīng)使用血清樣品。 血漿只比血清多含一種纖維蛋白原，而血纖維蛋白幾乎不與藥物結(jié)合，因此兩者的藥物濃度是一樣的，且測(cè)定血藥濃度的方法也是通用的。 注意：血漿或血清有溶血時(shí)可能會(huì)影響測(cè)定 藥物不穩(wěn)定時(shí)，用血漿更好83全血的制備 采集的

4、血液置于含有抗凝劑的試管中，輕輕混勻，不離心，防止凝血，保持血漿和血細(xì)胞混合在一起。 需要測(cè)全血中血藥濃度的情況：測(cè)定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的血藥濃度血漿藥物濃度波動(dòng)大，且難以控制血漿藥物濃度太低9二尿液 尿藥測(cè)定的目的與血液、唾液樣品不同，主要用于藥物劑量回收研究、藥物尿去除率、生物利用度的研究，并可推斷患者是否違反醫(yī)囑用藥，預(yù)測(cè)藥物的代謝過(guò)程及測(cè)定代謝類型 體內(nèi)藥物去除主要是通過(guò)尿液排出，藥物可以原型母體藥物或代謝物及其綴合物conjugates等形式排出。10 尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大；因?qū)儆诜菗p傷性采樣方式，收集方便。但由于易受食物種類、飲水多少、排汗情況等影響，并且在尿液排

5、出過(guò)程中，不僅包括腎小球的濾過(guò)，還包括腎小管的重新吸收，因此，尿藥濃度變化較大，與血藥濃度的相關(guān)性很不理想。11 尿藥濃度變化大，應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中藥物的總量。 健康人排出的尿液是淡黃色或黃褐色，成人一日的排尿量為1-5L，尿液的密度為1.1051.020，PH值在4.88.0之間。放置后會(huì)析出鹽類，并有細(xì)菌繁殖、固體成分的崩解，因而使尿液變渾濁。由于這些原因，必須參加適當(dāng)?shù)姆栏瘎┍４妗?動(dòng)物試驗(yàn)中用代謝籠收集尿、糞，只能以時(shí)間段采集，有時(shí)會(huì)有收集不到的情況。12 尿樣 優(yōu)點(diǎn)： 容易獲得，屬非損傷性取樣，且樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品；蛋白含量

6、極低，不需去蛋白處理。 缺點(diǎn)： 與血藥濃度不相關(guān)，難以反映藥物作用過(guò)程；受腎功能、pH影響；難以定時(shí)定量取樣，易污染；所含成分復(fù)雜，其中有紫外吸收的化合物就達(dá)數(shù)十種。 尿樣測(cè)定多用于藥物排泄、生物轉(zhuǎn)化研究。13三 唾液 唾液是無(wú)損傷性采樣，易收集。一些藥物的唾液藥濃S與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此，在TDM中可利用測(cè)定S代替P監(jiān)測(cè)；唾液樣品也可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。14腮腺分泌水、淀粉酶舌下腺、頜下腺分泌粘液和漿液質(zhì)的混合液唾液分泌量1200ml蛋白含量為血漿的十分之一PH6.2-7.4，變化大 15 唾液的采集應(yīng)盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下進(jìn)行。一般在漱口后15min收集，至少采集10 mi

7、n。 采集混合唾液也可用物理或化學(xué)的方法刺激，在短時(shí)間內(nèi)得到大量的唾液。 非刺激法條件下唾液直接流入容器內(nèi)，流速慢，僅約0.05 mL/min。物理刺激法唾液分泌流速為13mL/min; 化學(xué)刺激法是用酸刺激味覺(jué)或者毛果蕓香堿刺激唾液分泌，流速可達(dá)510mL/min。 唾液的采集16 Crouch研究發(fā)現(xiàn)：采集方法對(duì)唾液中藥物濃度有顯著影響，實(shí)驗(yàn)證明唾液中可待因的平均濃度在非刺激條件下比酸刺激條件下高3.6 倍，比機(jī)械性刺激低50%，是商品化采集裝置的77%。 shellee 的實(shí)驗(yàn)證明：酸刺激組和非刺激組相比，非刺激組唾液與血液藥物濃度相關(guān)度( 0.901) 明顯高于酸刺激組( 0.872)

8、 ， 說(shuō)明酸刺激采集對(duì)唾液與血液藥物濃度相關(guān)性有不利影響。17優(yōu)點(diǎn)：不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，可反復(fù)采集，采集時(shí)無(wú)痛苦、無(wú)感染危險(xiǎn)；唾液成分比血液、尿液簡(jiǎn)單，提取方便，有時(shí)可直接上樣測(cè)定；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。18 缺點(diǎn)： 唾液是各腺體分泌的的混合液體，其組成發(fā)生經(jīng)時(shí)變動(dòng)；因此，唾液中的藥物濃度與血漿中的游離型藥物濃度相比就容易變動(dòng)； 唾液中藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值(S/P)只有少數(shù)藥物是恒定值。 有些與蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測(cè)到 對(duì)有些患者昏迷不能采集唾液樣品。19 唾液在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用： 唾液

9、樣品比血液樣品易采集，樣品成分簡(jiǎn)單， 前處理方便。有的藥物在血液與唾液中的濃度密切相關(guān)， 可以考慮用唾液代替血液作為藥物監(jiān)測(cè)的樣本。唾液與血液中藥物含量的相關(guān)性研究， 可以為藥物的檢測(cè)和法醫(yī)學(xué)鑒定提供理論根底 林中等對(duì)四種抗癲癇藥物在唾液與血清中濃度的相關(guān)性進(jìn)行了研究， 結(jié)果顯示, 四種藥物在唾液與血清中的濃度之間有較好的線性關(guān)系， 其 r 分別為: 卡馬西平0.973 0；苯妥英鈉0.955 6； 苯巴比妥0.962 0； 丙戊酸鈉0.928 6，可根據(jù)唾液藥物濃度來(lái)計(jì)算相應(yīng)的血藥濃度值。20(四) 組織 在藥物動(dòng)物試驗(yàn)及臨床上由于過(guò)量服用藥物而引起的中毒死亡時(shí)，藥物在臟器中的分布情況可為藥

10、物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)過(guò)程提供重要信息。首先，將檢材均勻化，制成水基質(zhì)溶液，再用適當(dāng)方法提?。?5.有機(jī)溶劑萃取法4. 酶水解法3. 酸水解或堿水解2. 沉淀蛋白法1. 勻漿化法21五 頭發(fā) 頭發(fā)樣品具有廣譜性、積累性、穩(wěn)定性、依時(shí)性、相關(guān)性、指紋性 毛發(fā)樣品取樣方便，無(wú)傷害，檢樣摻偽可能性低，能得到以往較長(zhǎng)時(shí)間的用藥情況信息，可用于體內(nèi)微量元素的含量測(cè)定，但預(yù)處理復(fù)雜，分析對(duì)象含量低，需要精密儀器測(cè)定。 毛發(fā)通過(guò)毛根的毛細(xì)血管供給營(yíng)養(yǎng)，藥物、微量元素就是從這些毛細(xì)血管進(jìn)入毛發(fā)中。 22 濫用藥物、抗抑郁藥和抗精神病藥等藥物都有長(zhǎng)期用藥的方式，由于藥物在頭發(fā)中的積累和儲(chǔ)存,為這些藥物

11、的檢測(cè)提供了可能性。 尼古丁、卡馬西平、阿米替林、多慮平、安坦、氯丙嗪、泰爾登、三氟拉嗪、氯氮平和氟哌啶醇等精神藥物均能進(jìn)入頭發(fā)，但進(jìn)入頭發(fā)的難易程度是不一致的。藥物進(jìn)入頭發(fā)的難易程度可能與藥物的分子量、極性和脂溶性有關(guān)。指甲與頭發(fā)類似23二、生物樣品的貯存與處理一 冷藏或冷凍 采樣后除立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)： 短期保存，可 4 冷藏長(zhǎng)期保存，可20 冷凍，不要反復(fù)凍融。 小技巧：按測(cè)定時(shí)需要的體積分裝一支！24二有時(shí)，還應(yīng)考慮參加穩(wěn)定劑：酶抑制劑：一些酯類藥物，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，那么應(yīng)在采樣后立即參加酶抑制劑如氟化鈉等?？寡趸瘎阂恍┮籽趸乃幬铮?/p>

12、可參加維生素C或其它抗氧化劑。如血漿中兒茶酚類藥物常規(guī)保存僅4周，假設(shè)參加適量VC，那么能保存10周。奧氮平很容易被空氣氧化，因此在樣品的儲(chǔ)存和提取時(shí)參加了25%的維生素C 溶液10ul 作為抗氧劑25第二節(jié) 生物樣品的預(yù)處理與制備 進(jìn)行體內(nèi)藥物分析時(shí)，除了極少數(shù)情況下只需將樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單處理就可以直接測(cè)定外，都要采取別離、凈化、濃縮、化學(xué)衍生化等預(yù)處理技術(shù)，為測(cè)定創(chuàng)造良好的條件。 樣品預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)，也是分析中最困難、最繁復(fù)的工作。由于藥物在體內(nèi)存在形式不同、待測(cè)藥物濃度低、生物介質(zhì)組份繁雜、待測(cè)藥物類型眾多、理化性質(zhì)各異等原因，對(duì)生物樣品的預(yù)處理很難規(guī)定固定的程序和模式

13、，而必須結(jié)合實(shí)際情況，采取適當(dāng)?shù)膭e離、凈化、濃集、化學(xué)衍生化等技術(shù)。2660%以上工作和費(fèi)用用在樣品前處理上27一將藥物從綴合物尿或結(jié)合物中釋放出來(lái)，以測(cè)定藥物的總濃度二將微量藥物從復(fù)雜的介質(zhì)中純化、富集出三為適應(yīng)和符合分析方法所要求的專屬性、靈敏度等。四防止分析儀器的污染，提高測(cè)定靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和選擇性等一、生物樣品預(yù)處理的目的28二、樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題預(yù)處理時(shí)要考慮以下問(wèn)題：1.被測(cè)組分的理化性質(zhì)、存在形式、濃度范圍2.測(cè)定目的3.生物樣品種類和基質(zhì)干擾類型4.樣品的化學(xué)組成5.藥物的蛋白結(jié)合率6.被測(cè)組分在預(yù)處理過(guò)程中的穩(wěn)定性7.樣品在收集、儲(chǔ)存和預(yù)處理過(guò)程中的容器污染8.預(yù)

14、處理過(guò)程盡量簡(jiǎn)單、盡可能高的精密度和準(zhǔn)確度9.預(yù)處理的最后一步應(yīng)使被測(cè)組分富集10.選用的分析方法是否具有專屬性、是否滿足靈敏度要求29一藥物的理化性質(zhì)和存在形式二待測(cè)藥物的濃度范圍三藥物測(cè)定的目的四選用的生物樣品類型五樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系二、樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題其中5個(gè)重點(diǎn)問(wèn)題：30一經(jīng)有機(jī)破壞的方法1.濕法破壞 硝酸-高氯酸法；電熱消化器法；電熱板消化法； 烘箱消化法。2.干法破壞 高溫電阻爐灰化法；低溫等離子灰化法3.氧瓶燃燒法三、生物樣品的預(yù)處理技術(shù)以上方法將有機(jī)物破壞，只能進(jìn)行元素分析31 二去除蛋白質(zhì)目的： 去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物的總濃度；去除蛋白

15、質(zhì)也可預(yù)防提取過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)泡，減少乳化的形成，以及可以保護(hù)儀器性能，延長(zhǎng)使用期限32去除蛋白質(zhì)有以下幾種方法1. 溶劑解法-參加與水相混溶的有機(jī)溶劑操作簡(jiǎn)單，快速，精密度好常用，特別在LC-MS法中乙腈血漿=1.51，99.4%蛋白沉淀，顆粒大，易離心除去 甲醇血漿=3.01，98.9%蛋白沉淀，顆粒小，不易離心除去 2. 參加中性鹽 常用飽和硫酸銨、硫酸鈉333. 參加強(qiáng)酸 10%三氯醋酸、6%高氯酸 4. 參加含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 5. 超濾法 蛋白質(zhì)大分子不能通過(guò)半透膜 游離藥物 6. 酶水解法 枯草桿菌酶，貴，時(shí)間長(zhǎng) 少用 7. 加熱法 少用 疑問(wèn)：2、4法中的鹽使溶液的極性更強(qiáng)，藥

16、物會(huì)游離出？ 在色譜法中，高濃度的鹽會(huì)析出，把柱子堵了34 以上去除蛋白質(zhì)法僅去除了蛋白質(zhì)只起到保護(hù)色譜柱的作用，但內(nèi)源性的雜質(zhì)都在，樣品濃度還被稀釋。根本上不能用光譜法測(cè)定。 假設(shè)用色譜法別離，干擾嚴(yán)重，就得花更多的精力才能別離好。 對(duì)色譜法來(lái)說(shuō)，它不是好方法35三別離、純化與濃集 有差異才有可能別離！ 生物樣品含有大量可影響測(cè)定的內(nèi)源性雜質(zhì)，加上服用的藥物、代謝物、同時(shí)服用的其他藥物，組成一個(gè)極其復(fù)雜的混合物。 如何將微量的藥物從如此復(fù)雜的混合物中別離出來(lái)？361. 液-液萃取法LLE原理：多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物樣品中的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是

17、強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)差異。因而用有機(jī)溶劑萃取一次即可除去大局部雜質(zhì)，從大量的樣品中提取藥物經(jīng)濃集后測(cè)定。37采用LLE要考慮的幾個(gè)問(wèn)題1溶劑的選擇與純度要求 純度AR以上 了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，按相似相溶原那么選用對(duì)藥物的未電離分子可溶，而對(duì)電離形式的分子不溶光譜分析法沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、濃集與水不相混溶無(wú)毒，不易燃燒不易形成乳化氯仿易乳化，毒性大具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性不影響紫外測(cè)定 表3-6 毒性大的盡量不用383水相的PH值 主要由藥物的pKa決定！當(dāng)pH與pKa相當(dāng)時(shí)，50%藥物以非電離形式存在。對(duì)于堿性藥物，最正確pH值要高于pKa 1-2單位；對(duì)于酸性藥物來(lái)說(shuō)，那么要低于pK

18、a值1-2單位。這樣就可使90%的藥物以非電離的形式存在從而更易溶于有機(jī)溶劑中！丙戊酸的pKa4.95 但生物樣品一般多在堿性下提取。因?yàn)槎鄶?shù)藥物是親脂性的堿性物質(zhì)，而生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)多是酸性的，在堿性下用有機(jī)溶劑提取時(shí)內(nèi)源性雜質(zhì)不會(huì)被提取出來(lái)2有機(jī)溶劑相和水相的體積比 11或21 由實(shí)際情況決定，文獻(xiàn)中有的101以上39由于血藥濃度較低，提取時(shí)需濃集 傳統(tǒng)的濃集方法主要有兩種：一種是在末次提取時(shí)參加的提取液盡量少，使被測(cè)組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測(cè)定。 另一種是揮去提取溶劑后，再用少量適合的溶劑溶解后測(cè)定。40補(bǔ)充幾點(diǎn)科研中的心得1乳化問(wèn)題2在水相中參加中性鹽，提高萃取效

19、率 3在有機(jī)相中參加另一種改性的有機(jī)溶劑，提高萃取效果 4使用EP管作為提取容器41 衡量提取方法優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)就是提取回收率，它是指藥物從生物樣品中被別離出來(lái)用于測(cè)定的比例，一般應(yīng)高于60% 中科院上海藥物藥檢所 藥物代謝中心 李川博士說(shuō)“乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%藥物的萃取42 液-液回提屢次提取 對(duì)于堿、酸性藥物，在有機(jī)溶劑初次提取后，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H值，使藥物變成離子型，用水把藥物回提反提取back extraction到水相：然后調(diào)節(jié)水相pH，使藥物變成分子型，再用有機(jī)溶劑萃取水相中的藥物。一些酸、堿性雜質(zhì)，可用此法除去。 光譜法測(cè)定時(shí)，常采用此法凈化樣品。但屢次提取，得率

20、低 43 離子對(duì)提取 一些電離性較強(qiáng)調(diào)PH沒(méi)用的藥物在水溶液中主要以電離形式存在，很難被提取，此時(shí)，假設(shè)加適當(dāng)?shù)姆措x子counter ion 與其形成離子對(duì)大分子復(fù)合物，那么成為一種偽中性分子，能從水相進(jìn)入有機(jī)相中，就可用萃取法提取。 常用的反離子有：季銨鹽 R4N+陽(yáng)離子；苦味酸 C6H3NO23O-有機(jī)磺酸鹽 CH3- -SO3-陰離子；常用的提取溶劑為鹵代烴類，如CH2Cl244文獻(xiàn)上常提到的LLE的缺點(diǎn) 傳統(tǒng)萃取方式回收率低、樣品用量大、繁瑣費(fèi)時(shí)、溶劑用量大、溶劑毒性大、易乳化、不能自動(dòng)化操作45試驗(yàn)設(shè)計(jì)：現(xiàn)有1.9mL空白血漿，為篩選9種有機(jī)溶劑中哪一種對(duì)某藥物的萃取效果最好，該如何

21、將藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液參加血漿中？畫示意圖即可。9支EP管，每管0.19mL血漿及10L藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液小測(cè)試462.固相萃取法 固相萃取(Solid Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開(kāi)始開(kāi)展起來(lái)的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合開(kāi)展而來(lái)。主要通過(guò)固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸咐及解吸過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的別離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。47固相萃取的根本原理和方法： SPE 技術(shù)基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、別離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過(guò)程；也可以將其近似地看作一種簡(jiǎn)單的色譜過(guò)

22、程。 較常用的方法是使液體樣品通過(guò)一吸附劑，保存其中被測(cè)物質(zhì)，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而到達(dá)快速別離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測(cè)物質(zhì)流出。差異48 關(guān)于固相萃取小柱：a.常見(jiàn)的固相萃取柱分為三局部：醫(yī)用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯篩板(20m)和填料(多為40-60m，80-100m)。b.常用規(guī)格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml為例： 其中100mg為填料的質(zhì)量，1ml是空柱管的體積。c.一次性使用：為防止交叉污染，保證檢測(cè)可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。49SPE填料吸

23、附型:活性炭，硅膠，硅藻土，硅酸鎂，氧化鋁等?；瘜W(xué)鍵合相硅膠，正相：氨基，腈基，二醇基等；反相：C1，C2，C6，C8，C18，腈基，環(huán)己基，苯基離子交換：季胺，氨基，二氨基，苯磺酸基，羧基等。聚合物：苯乙烯-二乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等；乙烯吡咯烷酮和二乙烯萃共聚得到的高分子聚合物。相對(duì)于鍵合相填料，聚合物具有高純度，高比外表的特點(diǎn)。因而具有比硅膠基質(zhì)更強(qiáng)的吸附性，適用于全部pH范圍，因而用途更廣50固相萃取操作一般有五步：活化甲醇潤(rùn)濕小柱，活化填料，除去雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。平衡水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱，保持濕潤(rùn)？上樣將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保存在柱上。棄去廢液

24、淋洗水或緩沖液最大程度除去干擾物。洗脫用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來(lái)并收集。親脂性鍵合相硅膠SPE柱的實(shí)驗(yàn)步驟：5152WATERS公司的Oasis HLB柱聚合物基質(zhì)53離子交換樹脂 對(duì)弱酸性的藥物，可在中性或堿性的條件下用陰離子交換樹脂提取，用水及有機(jī)溶劑清洗后用酸性的溶液洗脫；堿性藥物那么相反。 離子交換法萃取的回收率?？蛇_(dá)90%以上，而且有較好地選擇性，但較麻煩，費(fèi)時(shí)。54親水型填料 用作SPE的親水型填料有硅藻土、硅膠、棉纖維等，其原理為分配作用。填料為支持物，水基質(zhì)中極性強(qiáng)的成分與填料結(jié)合牢固，流動(dòng)相為與水不相混溶的有機(jī)溶劑，較親脂的藥物易分布于流動(dòng)相，從而到達(dá)萃取的目的。 親水

25、型填料SPE有較高的萃取回收率大于80%，但洗脫劑用量較大一般大于5ml，無(wú)濃集作用，萃取液較干凈。55固相萃取裝置真空SPE裝置(SPE Vacuum Manifolds)組成：有機(jī)玻璃缸體，真空壓力表，真空泵，真空緩沖瓶，收集管架，小柱連接頭12孔 6500元24孔 11000元5696孔板 96孔板是高通量的SPE產(chǎn)品，每孔含少量吸附劑(10-100mg), 樣品載量約2ml/孔 主要用于生物，醫(yī)藥等行業(yè)小量的多樣品的凈化處理。且多與自動(dòng)化的樣品處理處理裝置連用(如Tomtec液體處理工作站)。其根本原理和使用方法與SPE柱相似。96孔板57SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍

26、較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動(dòng)化；7、室溫下操作，尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。 目前，商品化固相提取小柱cartridge的應(yīng)用已比較普遍。最大的缺點(diǎn)： 貴 20多元/支58三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較59 以液-液萃取去除內(nèi)源性雜質(zhì)的效率最高，固相萃取次之，蛋白沉淀最差。但蛋白沉淀用有機(jī)溶劑由于操作步驟少，樣品處理快，數(shù)據(jù)精密度高，在有液質(zhì)的高靈敏度、高選擇性作保證的前提下，該種方法使用最多LC-MS/MS。 魏敏吉北大附屬第一醫(yī)院臨床藥理研究所綜述 另外，在所查的24篇抗癲癇藥物的HPLC分析中，溶劑萃取法22篇，蛋白沉淀法2篇，無(wú)SPE法！60Oasi

27、s HLB固相萃取柱王朝虹，公安部物證鑒定中心乙酸乙酯萃取高效液相色譜法測(cè)定血漿中雷公藤內(nèi)酯醇內(nèi)源性雜質(zhì)都有固相萃取與液-液萃取的比較613.自動(dòng)化SPE技術(shù)自動(dòng)化固相萃取裝置了解400 樣品/小時(shí) 沒(méi)實(shí)際意義 臨床藥學(xué)測(cè)定的品種多儀器昂貴624.固相微萃取法 類似于氣相色譜微量進(jìn)樣器的萃取裝置熔融石英纖維上面涂有有機(jī)聚合物(如聚二甲基硅氧烷，PDMS) SPME 集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一身，極大地提高了分析速度。萃取模式可分為直接固相微萃取和頂空固相微萃取了解63 用固相微萃取一氣相色譜聯(lián)用別離、分析尿中痕量毒鼠強(qiáng)。方法的線性范圍為10一500ng/ml，最低檢出濃度10ng/ml， RSD

28、1 0%。用該法監(jiān)測(cè)了1例毒鼠強(qiáng)中毒幼兒尿中毒鼠強(qiáng)含量，在中毒后 3 個(gè)月內(nèi)仍從尿中檢出毒鼠強(qiáng)成分，適用于臨床和法庭毒物分析。案例：645.膜萃取 徽粒填料薄膜(Particle-loaded membrane) 固定相填料有C8、C18鍵合硅膠、SDB、離子交換劑、碳微粒等；薄膜介質(zhì)為多孔網(wǎng)狀聚四氟乙烯(PLFE)、聚氯乙烯等高分子材料或玻璃纖維。PLM截面積較大，厚度小，壓差小，樣品流速可達(dá)同類型填料柱型SPE 10倍左右，而且在高流速條件下不會(huì)像柱型SPE一樣造成回收率下降。這主要由于PLM填料粒較小，多為8m，且填料緊密而均勻，穩(wěn)固不易產(chǎn)生縫隙，每0.5mm薄膜可提供4一9理論塔板數(shù)；

29、而SPE柱填料粒徑多為40 m ，每厘米只能提供5一15理論塔板數(shù)。了解656.微透析技術(shù)Microdialysis 微透析技術(shù)實(shí)質(zhì)上是一種膜別離技術(shù)，是一種利用膜透析原理，微量地對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行流動(dòng)性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術(shù)。 由于微透析針很細(xì)，可在根本不干擾生物體內(nèi)正常生命過(guò)程的情況下，直接插到生物活體內(nèi)采樣進(jìn)行在體(in vivo)、實(shí)時(shí)( real time)和在線(on line)的取樣和檢測(cè)，用來(lái)研究生物體在活動(dòng)時(shí)體液組成的變化。661原理 微透析的取樣裝置主要由注射泵、微透析探針、連接管和收集器組成。將微透析探針埋植于需要取樣的部位，用與細(xì)胞間液非常接近的生理溶液以慢速

30、0.5-5l/min 灌注探針，由于半透膜的存在，與蛋白相結(jié)合的藥物及其他大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜而被排斥在探針外，只有游離的小分子物質(zhì)(如游離態(tài)藥物)會(huì)經(jīng)半透膜彌散進(jìn)入灌流液而被連續(xù)不斷地帶出，儲(chǔ)于樣品收集器中，到達(dá)在體取樣的目的。67微透析取樣系統(tǒng)的組成(A)及探針取樣的局部放大圖(B)682微透析技術(shù)的特點(diǎn)(1)時(shí)間分辨性-可連續(xù)跟蹤體內(nèi)多種化合物濃度隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，可使藥代動(dòng)力學(xué)資料更準(zhǔn)確；(2)空間分辨性-取樣無(wú)需勻漿過(guò)程，可真實(shí)代表取樣位點(diǎn)目標(biāo)化合物的濃度。同時(shí)，可以對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行多個(gè)部位取樣，研究目標(biāo)化合物的體內(nèi)分布；(3)樣品純潔，不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可不經(jīng)預(yù)處理，與

31、多種分析儀器聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)在線持續(xù)分析；69(4)直接測(cè)定游離藥物濃度，與血液取樣技術(shù)相比，游離藥物濃度與其藥理或毒理作用的相關(guān)性更大；(5)可在清醒、自由活動(dòng)的動(dòng)物個(gè)體上取樣，在接近正常生理?xiàng)l件下得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更有科學(xué)性和實(shí)際意義；(6)能夠防止傳統(tǒng)血液取樣后由于體液容量減少而引起的藥物PKPD行為的改變，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)組織長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)取樣而不造成體液損失；(7)組織損傷小，不破壞機(jī)體完整性。707.超臨界流體萃取 SFE超臨界流體：處于臨界溫度和臨界壓力以上，介于氣體和液體之間的流體。超臨界流體同時(shí)具有氣體和液體的雙重特點(diǎn)影響SFE的因素有：溫度、壓力、提攜劑、提取時(shí)間等 缺點(diǎn)：特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、使用

32、高純的超臨界流體。了解71 尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。 含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物； 含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。 由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取，常用酸水解或酶水解的方法。四綴合物的水解72 3 溶劑解：綴合物主要是硫酸酯往往可通過(guò)參加的溶劑在萃取過(guò)程中被分解。2酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37數(shù)小時(shí)，條件溫和，選擇性強(qiáng)，但費(fèi)用較高。1酸水解：0.1N HCl，100，30min， 條件較劇烈，易致藥物分解，空白值也高。為測(cè)定尿液中藥物總量，

33、要將綴合物水解：73 值得注意的是，目前對(duì)綴合物的分析，逐漸趨向于直接測(cè)定綴合物的含量，以獲得體內(nèi)以綴合物形式存在的量，以及當(dāng)排出體外時(shí)，綴合物占所有排出藥物總量的比率，從而為了解藥物代謝情況提供更多的信息。74五化學(xué)衍生化 藥物分子中含有活潑H者均可被化學(xué)衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團(tuán)的藥物都可被衍生化。色譜分析法光譜分析法 ？ 色譜分析是別離分析方法，大局部樣品處理后就可上樣分析，但某些藥物或代謝物極性大、揮發(fā)性低、對(duì)熱不穩(wěn)定、與其它物質(zhì)別離不好或?qū)z測(cè)器不夠靈敏，因此，需要先進(jìn)行衍生化反響，然后測(cè)定衍生物。751. GC 法中的化學(xué)衍生化法目的： 使極

34、性藥物變成非極性的、易于揮發(fā)的藥物，使具有能被別離的性質(zhì)； 增加藥物的穩(wěn)定性；含-NH2、-COOH、-OH官能團(tuán)的藥物常使色譜峰拖尾；為提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體的別離能力。 主要的衍生化反響有烷基化、?；?、硅烷化、及生成非對(duì)映異構(gòu)體衍生化法等。其中以硅烷化用得最廣泛。76 常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺TMAH等； 常用的?；噭阂宜狒?、丙酸酐等； 硅烷化試劑：三甲基氯硅烷TMCS、雙-三甲基硅烷乙酰胺BSA、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺BSTFA、三甲基硅咪唑TMSI等。77 具有光學(xué)異構(gòu)體藥物的別離可采用不對(duì)稱試劑，使其生成非對(duì)映異構(gòu)體衍生物，然后用GC法進(jìn)行分析測(cè)定。常用的不對(duì)稱試劑有：S-N-三氟乙酰脯氨酰氯、S-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。782. HPLC法中化學(xué)衍生化法 高效液相色譜(HPLC)儀在我國(guó)已很普