核醫(yī)學第二講體外分析

1、體外分析 1960年美國的Berson和Yalow 將核技術(shù)與免疫學技術(shù)相結(jié)合建立了放射免疫分析法，并首先用于測定血漿胰島素濃度，由于該法對醫(yī)學的巨大貢獻，1977年Yalow獲得了Nobel獎。Yalow2體外分析以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。 3體外分析技術(shù)體外放射分析非放射標記免疫分析放射免疫分析（RIA）免疫放射分析 (IRMA)受體的放射配基結(jié)合分析(RBA)酶免疫分析(EIA)化學發(fā)光免疫分析(ECLA)時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)4 Radioimmunoassay

2、,RIA 放射免疫分析5RIA的基本原理競爭抑制結(jié)合反應(yīng)： 放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標記抗原（Ag）與定量的標記抗原（*Ag）對限量的特異性抗體（Ab）的競爭抑制結(jié)合反應(yīng)。6基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) *Ag與Ag 免疫活性相同*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)7Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+Ag8 AgAb Ag.Ab Ag* Ag*.AbAg*與Ag由于免疫化學性質(zhì)一致，共同競爭性與

3、Ab結(jié)合當Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*與Ag之和大于Ab時，則Ag*.Ab復(fù)合物的形成受Ag含量的制約，二者之間存在函數(shù)關(guān)系，即隨著Ag濃度的增加，Ag*.Ab復(fù)合物也減少，因為Ag*對Ab的結(jié)合被Ag競爭性抑制9標準曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標準抗原和一定量的標記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進行反應(yīng)；在反應(yīng)達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測量B和F的放射性；用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標，反應(yīng)劑量作為橫坐標（即一系列標準抗原）作一條曲線，就得到不同濃度的標準抗原對反應(yīng)變量的競爭抑制曲線，這就是劑量反應(yīng)曲線。 10Ag2550100200400800*AgAb分

4、離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？11B%標 準 曲 線12在實際的操作中，一般要設(shè)立：最大結(jié)合管（零標準管Bo）：標準抗原的量為0，只有標記抗原和特異性抗體時，標記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測得的B的放射性為Bo。這是沒有標準抗原與之競爭時，標記抗原和抗體的結(jié)合達最大值。非特異結(jié)合管（NSB）：標記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測得的放射性。RIA中的測定管13總放射性管（T）：反應(yīng)后不分離就直接測得的放射性就是總放射性。表示標記抗原抗體復(fù)

5、合物和游離的標記抗原的總放射性。標準管（B1Bn）：放有不同濃度的標準抗原，再加入相同量的標記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測定沉淀的放射性作為B。樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標準管中的標準抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀測得其放射性，就可以在繪制的標準曲線上找到樣品的濃度。14標準曲線左：橫座標為等份刻度；右：橫座標為對數(shù)刻度 15RIA基本技術(shù)標準品（標準抗原）標記抗原抗體分離技術(shù)標準曲線16標準抗原的要求標準抗原與待測抗原、標記抗原具有基本相同的免疫活性，即質(zhì)同。他們的化學結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)要相同，對特異性抗體的親和力要相同。并且，標準抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相

6、同。17標準抗原的定量要準確：整個RIA分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標準抗原的量，因此標準抗原的定量一定要準確，即與國家規(guī)定的標準品相比有良好的可比性。只有保證標準抗原的準確定量，才能保證RIA分析系統(tǒng)的準確度和精確度。18標準抗原必須高純度：標準抗原應(yīng)該含有盡可能少的化學雜質(zhì)，以避免雜質(zhì)對反應(yīng)和計量的影響。標準抗原的穩(wěn)定性要好：要保證在試劑盒的運輸、儲存和在實驗過程中應(yīng)該不發(fā)生降解，分離、破壞等。19標記抗原指抗原分子中有一個或兩個原子被放射性核素所取代。 最常用的是125I，因為他的比活度比較高，標記和測量都相對容易，且半衰期合適（60天）利于商品化。 20標記抗原的要求質(zhì)同，即標記抗原與標準抗

7、原、待測抗原的化學性質(zhì)和免疫活性要相同。 標記抗原要有適當高的放射性比活度。比活度高則在允許的相同的測量統(tǒng)計誤差的前提下，所使用的標記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競爭的待測抗原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損的問題。 21標記抗原要有足夠高的放射化學純度，一般要大于95%。放射化學純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對RIA的免疫反應(yīng)和動力學參數(shù)產(chǎn)生影響。由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標記抗原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。22標記抗原的穩(wěn)定性要好：和標準抗原相比，標記抗原由于有了放射性核素射線的影響，更容易發(fā)生分解。

8、在標記抗原的儲存上，應(yīng)遵循標記化合物的保存原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。23特異性抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體?？贵w的質(zhì)量之間關(guān)系到RIA分析方法的靈敏度和特異性。24多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種小動物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。制備的方法成熟、簡便、生產(chǎn)量大；但是里面成份復(fù)雜，免疫反應(yīng)的動力學規(guī)律復(fù)雜。單克隆抗體是通過雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份單一、穩(wěn)定、特異性強；但成本較高。25抗體的要求（三高）高親和力高特異性高滴度26抗體的檢測指標1. 親和常數(shù)K（affinity constant）：親和常數(shù)反應(yīng)了抗體與抗原的親和力。K值越大，形成抗體抗原復(fù)合物速

9、度快，解離少，靈敏度高，準確度和精確度都好。K=結(jié)合常數(shù)k1 / 解離常數(shù)k2 。 272.交叉反應(yīng)率指抗體識別相應(yīng)抗原類似物的能力，反應(yīng)了抗體的特異性。在生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反應(yīng)率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉反應(yīng)就越小，其識別抗原類似物的能力就越強，特異性就越強。 28常用50%置換法來測定交叉反應(yīng)的百分率。即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線，比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（B/B0=50%）時的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率，也就是該抗體對被測物某種類似

10、物的相應(yīng)活力。 293.滴度又稱稀釋度，反映了抗血清中有效抗體的濃度。指在沒有標準抗原存在的時候，結(jié)合50%的標記抗原時抗血清的稀釋度。其方法就是用緩沖液將抗血清稀釋為不同的濃度，各置于試管中，然后各加一定量的標記抗原進行反應(yīng)，等到反應(yīng)平衡后分離B和F，測出B的放射性，算出B%，以B%為縱坐標以抗血清的稀釋度為橫坐標作出抗血清稀釋曲線，B%為50% 所對應(yīng)的抗血清滴度為工作滴度。 30RIA的分離方法指分離標記抗原抗體復(fù)合物（B）和游離標記抗原（F）的方法。根據(jù)使用的分離劑不同可以分為：非特異性分離方法：利用物理、化學或生物化學的方法如吸附、過濾、沉淀等。特異性分離方法：利用免疫反應(yīng)的特異性來

11、進行分離的方法。常用的分離方法有雙抗體法 固相法等31分離方法的要求分離完全、快速。不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。32標準曲線的擬合方式標準曲線是衡量待測樣品中配體濃度的客觀尺度和基準反映檢測質(zhì)量的指標標準曲線要最大限度地反映量效關(guān)系便于自動化分析，使用靈活每一批分析必須做一條標準曲線。WHO推薦的數(shù)據(jù)處理模型是四參數(shù)單位點質(zhì)量作用模型和四參數(shù)logistic模型33 RIA特點 特異性強靈敏度高，可檢測10-910-12 g水平穩(wěn)定性好操作簡便適于多種生物活性物質(zhì)RIA

12、測量的是免疫活性34誤差的分類和來源 根據(jù)來源不同的誤差，可以把實驗中產(chǎn)生的誤差分為兩類：系統(tǒng)誤差隨機誤差35是由于試劑、儀器或操作方法上一個固定的缺陷而造成整批結(jié)果傾向性的偏差，影響了結(jié)果的正確性。如標準品不標準、加樣器不準等系統(tǒng)誤差引起的測定結(jié)果的偏差是固定的偏大或偏小。系統(tǒng)誤差是可以避免的。系統(tǒng)誤差36是由于實驗過程中各種偶然因素造成同一樣品多次測定的結(jié)果不一致。如加樣、分離、放射性測量等誤差的出現(xiàn)是隨機的，與真實值的偏離是雙向性的，可大可小。 隨機誤差無法避免。隨機誤差37質(zhì)量控制質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。

13、具體作用有：1檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。2識別誤差的來源并消除其原因。3改進測定方法的設(shè)計以提高質(zhì)量。 38RIA質(zhì)量控制指標 實驗室內(nèi)部的質(zhì)量控制側(cè)重于對檢測質(zhì)量的控制，保證從樣品收集到發(fā)出結(jié)果報告的整個過程中能及時發(fā)現(xiàn)各種誤差，并分析原因，找出糾正的方法。 質(zhì)量控制的指標包括：精密度、準確度、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性 39精密度指同一樣品重復(fù)測定的一致程度，即測定的重復(fù)性，通常用變異系數(shù)CV和標準差SD表示CV=SD/X批內(nèi)CV：同一樣品同批測定的變異系數(shù)批間CV：同一樣品不同批次測定的變異系數(shù)RIA中應(yīng)做復(fù)管或三管40是指測量值與真值的符合程度，其偏離真值的誤差就叫做偏差。在實際

14、工作中我們用設(shè)置質(zhì)控樣品、測定回收率或進行健全性評價的方法來判斷準確度。 準確度41回收率測定回收率（） （回收管測定值對照管測定值）/回收管加入的已知量100或回收率（） 回收管測定值/（對照管測定值回收管加入的已知量）100對照管：加入樣品回收管：加入樣品和已知量的分析物回收率一般為90110之間42質(zhì)量控制樣品是含有已知劑量待測物的血清樣本。質(zhì)控樣品和待測樣品為同一種物質(zhì)，具有相同的生物和免疫活性。質(zhì)控樣品的濃度應(yīng)準確定量并有合理的濃度范圍。通常是根據(jù)待測物在人體血清內(nèi)的正常濃度制定高、中、低三個劑量水平的質(zhì)控樣品。使用時將質(zhì)控樣品分置在待測樣品的不同位置中同時檢測。質(zhì)量控制樣品43質(zhì)控

15、圖44主要用于評價標準品與待測樣品的免疫活性是否一致。用反應(yīng)緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品稀釋曲線，如果樣品與標準品免疫活性相同，得到的曲線應(yīng)該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性實驗。 健全性45是指RIA方法剛能與不含有標準抗原的零標準管在統(tǒng)計學上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該RIA方法的最小可檢測量。確定靈敏度的方法主要有： 同一樣品10次測量結(jié)果的B/B090的劑量的平均值作為最小可測量。 以10次測量結(jié)果的B0管結(jié)合率均值減去2SD（標準差）的結(jié)合率的劑量對應(yīng)值為最小可測量。靈敏度46 方法的特異性主要取決于抗體的特異性。 用抗體的交叉反應(yīng)率來表示。特異性47穩(wěn)定性 測量結(jié)果的穩(wěn)

16、定性可以通過劑量反應(yīng)曲線的各個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。 如標準曲線的斜率和截距，非特異性結(jié)合率，零標準管結(jié)合率及其75%、50%、25%處的劑量值(ED75、ED50、ED25)。48操作基本步驟加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，一般是37。分離：選擇好的分離方法進行分離。測量：測量游離或結(jié)合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。 49免疫放射分析immunoradiometric assay, IRMA50基本原理免疫放射分析是一種非競爭性的抗原抗體反應(yīng)。 將放射性核素標記在抗體上，用過量的抗體

17、與抗原結(jié)合，反應(yīng)平衡后，用分離方法除去多余的抗體，測量抗原-標記抗體復(fù)合物的放射性。利用抗原-標記抗體復(fù)合物的放射性活度與抗原劑量之間的函數(shù)關(guān)系來測定待測抗原的量。 51雙位點法(Ab2為McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1+Ag (固相)Ab1.Ag (過量) + 過量Ab*2(McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去) sandwichAb1AgAb2*52B%B%擬合的標準曲線擬合的NSB擬合的標準曲線擬合的NSBIRMA的標準曲線及非特異結(jié)合曲線RIA的標準曲線及非特異結(jié)合曲線53RIA與IRMA區(qū)別RIA IRMA標記抗原 標記抗體定量抗體和標記抗原

18、 過量抗體和標記抗體競爭性結(jié)合 非競爭性結(jié)合抗原和標記抗原抗體 抗原和標記抗原抗體復(fù)合物呈負相關(guān) 復(fù)合物呈正相關(guān) 靈敏度、特異性更高 標記物的穩(wěn)定性好 待測抗原需有兩個抗原決定簇， 故不適于小分子多肽 54標記免疫技術(shù)發(fā)展方向放射免疫技術(shù) 免疫放射技術(shù)多克隆抗體 單克隆抗體放射性標記免疫技術(shù) 非放射性標記免疫技術(shù)55非放射性標記免疫分析技術(shù)Enzyme immunoassay,EIAChemiluminescence immunoassay,CLIATime-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA56酶標記免疫技術(shù)EIA原理：酶標記（HRP、AP、GO等）生成酶標記抗

19、原抗體復(fù)合物相應(yīng)的酶的底物（如TMB、5-AS）生成有顏色的產(chǎn)物（如黃色、棕色）分光光度計測定顏色深淺（OD值）以決定待測含量57經(jīng)典ELISA雙抗法：測抗原固相載體Ab 固相AbAg 固相Ab-AgHRP-Ab 固相Ab-Ag-HRP-Ab 底物 顏色反應(yīng) 分光光度計測定OD間接法：測抗體固相載體Ag 固相AgAb 固相Ag-AbHRP-抗人IgG 固相Ag-Ab-HRP-抗人IgG底物 顏色反應(yīng) 分光光度計測定OD 58化學發(fā)光免疫分析技術(shù) 經(jīng)典的CLIA是用發(fā)光化合物異魯米那和吖啶酯為標記物，在堿性條件下遇過氧化物便能發(fā) 生單光子發(fā)射，光子數(shù)量和發(fā)光標記抗原抗體復(fù)合物呈正比59化學發(fā)光酶

20、免疫分析（CLEIA）標記物：堿性磷酸酶（ALP）底物：金剛烷測定：發(fā)光強度60化學發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶 發(fā)光發(fā)光底物Dioxetane光電倍增管測量光強度ALP標記Ag或Ab，形成Ag.Ab反應(yīng)去除游離部分溫育BECKMAN公司Access分析原理分為競爭法與夾心法兩類61電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應(yīng) 激發(fā)物：三丙胺 發(fā)光底物：三聯(lián)吡啶釕 標記物：三聯(lián)吡啶釕的衍生物N-羥基琥珀酰胺酯標記抗體62ECLIA反應(yīng)過程在電陽極上1.TPA失去電子氧化為陽離子自由基TPA，二價（基態(tài)）三聯(lián)吡啶釕被氧化為三價的三聯(lián)吡啶釕2. 陽離子自由基TPA性

21、質(zhì)不穩(wěn)定，自發(fā)地失去一個質(zhì)子變成自由基TPA（還原劑）3. 自由基TPA將一個電子給三價的三聯(lián)吡啶釕，從而生成二價的三聯(lián)吡啶釕（激發(fā)態(tài)），TPA則分解為二丙胺和丙醛4. 激發(fā)態(tài)二價三聯(lián)吡啶釕發(fā)射波長620nm光子，重新生成基態(tài)的二價三聯(lián)吡啶釕5. 上述過程周而復(fù)始，只消耗TPA63時間分辨熒光免疫分析（TrFIA）鑭系元素（如銪Eu）經(jīng)激發(fā)后能發(fā)出特征性熒光，其熒光壽命較一般干擾熒光長數(shù)倍，故稱時間分辨如：經(jīng)0.5s （340nm）脈沖光激發(fā)，延遲400 s ，用613nm檢測并記錄熒光強度400s ，間歇200 s 再次激發(fā)，每一工作周期僅1ms，每秒鐘可重復(fù)檢測1000次64時間分辨熒光檢測的基本原理示意圖熒光衰