微生物實(shí)驗(yàn)課件

1、微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告食品微生物檢測 菌落總數(shù)測定一、實(shí)驗(yàn)原理： 1、培養(yǎng)基原理 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 ：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族維生素；葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。 食品微生物檢測 菌落總數(shù)測定一、實(shí)驗(yàn)原理：2、細(xì)菌最適生長環(huán)境 a、多數(shù)細(xì)菌的最適溫度范圍基本相似，多為37左右 b、pH細(xì)菌對PH的適應(yīng)范圍較大為pH2.08.0，但多數(shù)細(xì)菌的生長最適PH為6.08.0 c、根據(jù)細(xì)菌對氧氣的需要可分為4類；需氧菌微需氧菌、兼性厭氧菌、厭氧菌、所以培養(yǎng)需氧細(xì)菌時(shí)，需要高氧分壓的環(huán)境，而培養(yǎng)厭氧細(xì)菌對，就要降低并嚴(yán)格控制環(huán)境中的氧分壓 2、細(xì)菌最適生長環(huán)境3、細(xì)菌的菌

2、落特征 一般呈現(xiàn)較濕潤、較光滑、質(zhì)地均勻，且菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致3、細(xì)菌的菌落特征4、菌落總數(shù)測定中的注意事項(xiàng)41 所用器皿及稀釋液411 檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試 管、移液器的吸頭等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。412 用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要查找原因，如可通過追加對照平板，以判定是空白 稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿、吸管或空氣可能存在的污染。4、菌落總數(shù)測定中的注意事項(xiàng)413 檢樣的稀釋液一般用滅菌鹽水，如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋，則宜用蒸餾水。做醋

3、時(shí)用20 一30 碳酸鈉調(diào)pH 至中性。413 檢樣的稀釋液一般用滅菌鹽水，如果對含鹽量較高的食 實(shí)驗(yàn)流程圖 實(shí)驗(yàn)流程圖實(shí)驗(yàn)步驟樣品：酸菜湯1 樣品的稀釋1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)1 min2 min，制成1:10 的樣品勻液。1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。實(shí)驗(yàn)步驟樣品：酸菜湯1.3 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10

4、樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，制成1:100 的樣品勻液。1.4 按6.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，做5 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，吸取1 mL 樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL 空白稀釋液加入1個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對照。1.6 及時(shí)將15 mL20 mL 冷卻至46 的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 1 恒溫水浴箱中保溫）傾注

5、平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。1.3 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻2 培養(yǎng)2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 1 培養(yǎng)48 h2 h。2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1 條件進(jìn)行培養(yǎng)。2 培養(yǎng)6.3 菌落計(jì)數(shù) 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。6.3.1 選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30

6、 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用3個(gè)平板的平均數(shù)。6.3.2 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。6.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。6.3 菌落計(jì)數(shù) 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖）濃度梯度為1:10實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖）濃度梯度為1:10濃度梯度為1:100濃度梯度為1:1000濃度梯度為1:100濃度梯

7、度為1:1000濃度梯度為0.0001濃度梯度為0.00001濃度梯度為0.0001濃度梯度為0.00001數(shù)據(jù)處理： 濃度梯度試管0.10.010.0010.00010.000011多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)34 22多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)2213多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)342數(shù)據(jù)處理： 濃度梯度0.10.010.0010.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得樣品中的菌落總數(shù)：N=（34+22+34）/310000 =300000實(shí)驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得樣品中的菌落總數(shù)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)樣品取自某食堂的免費(fèi)湯水，從本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，如果忽略實(shí)驗(yàn)誤差，某食堂免費(fèi)的湯水不符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果分析 本次實(shí)驗(yàn)樣品取自某食堂的免費(fèi)湯水，從實(shí)驗(yàn)三 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法培養(yǎng)基原理：1.月桂荃硫酸鹽胰蛋白際(LST)肉湯：胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑；月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群細(xì)菌的生長2.煌綠乳糖膽鹽(BGAB)肉湯：蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可發(fā)酵的糖類；牛膽粉和煌綠抑制非腸桿菌科細(xì)菌。3. EC肉湯：胰蛋白胨提供碳氮源；三號(hào)膽鹽抑制革蘭氏陽性菌，特別抑制革蘭氏陽性桿菌和糞鏈球菌；乳糖是可發(fā)酵的糖類；磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀為緩沖劑；氯化鈉可維持均衡的滲透壓。4.

9、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB）：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸氫二鉀是緩沖劑；瓊脂是培養(yǎng)基凝固劑；伊紅和美藍(lán)是抑菌劑和pH指示劑，可抑制革蘭氏陽性菌，在酸性條件下產(chǎn)生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外圍無色透明的菌落。實(shí)驗(yàn)三 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法5.營養(yǎng)瓊脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。6.色氮酸肉湯：胰 酪胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長需求7. MR-VP培養(yǎng)基：月示胨提供碳氮源、維生素和生長因子；葡萄糖為可發(fā)酵的糖類；磷酸氫二鉀是緩沖劑；氯化鈉維持均衡的滲透壓。 甲基紅（MR）試驗(yàn)：腸桿菌科的細(xì)菌在糖代

10、謝過程中，分解葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大腸桿菌分解丙酮酸，次生的酸類較多，pH為4.5或更低，甲基紅呈現(xiàn)紅色（陽性）。在產(chǎn)氣桿菌的培養(yǎng)液中一部分丙酮酸變?yōu)橹行缘囊阴＜谆状?，生成的酸類較少，pH在5.4以上，甲基紅呈現(xiàn)桔黃色（陰性）。 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖生成丙酮酸，某些細(xì)菌可使丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空氣中氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物。試驗(yàn)中加入萘酚是作催化劑，使反應(yīng)的顏色加深，提高反應(yīng)的敏感性。8.結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)：蛋白胨和酵

11、母粉提供碳氮源和微量元素；乳糖是可發(fā)酵的糖類；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌，特別抑制革蘭氏陽性桿菌和糞鏈球菌；中性紅為pH指示劑。5.營養(yǎng)瓊脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳伊紅為酸性染料，美藍(lán)為堿性染料。 當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)細(xì)菌帶正電荷被染成紅色，再與美藍(lán)結(jié)合形成紫黑色菌落，并帶有綠色金屬光澤。而產(chǎn)氣桿菌則形成呈棕色的大菌落 伊紅為酸性染料，美藍(lán)為堿性染料。 通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它

12、不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色 通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫革蘭氏染色的步驟a. 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。b. 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。c. 滴加95%乙醇脫色約15-30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。d. 滴加復(fù)染液，復(fù)染1

13、min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果 :革 蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏染色的步驟實(shí)驗(yàn)步驟4、 樣品稀釋 所用樣品：酸菜湯4.2.1液體食品 以 滅 菌 吸管取樣25mL放入裝有225m1無菌水的滅菌玻璃瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s內(nèi)4.2.2 固振搖25次(或以機(jī)械振蕩器振搖)，制成1:10的樣品勻液。固體和半固體食品 以無 菌 操 作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，干8000r/min均質(zhì)1-2min，制成1 : 10樣品勻液(也可用滅菌乳缽研磨的方法代替)。實(shí)驗(yàn)步驟4、 樣品稀釋固體和半固體食品5.大腸茵群的測定5.1 大腸菌群M

14、PN值的測定5.1.1 對每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白脈(LST)肉湯，每管接種1mL.5.1.2 將接種管置于36士1培養(yǎng)48士2h,5.1.3 觀察試管的產(chǎn)氣情況:檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h Ta 48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性;如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn)。5.大腸茵群的測定5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)5.2. 1 將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中。5.2.2 置BGLB肉湯管于36士1C培養(yǎng)48士2h,5.2.3 記錄所有BGLB

15、肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。5.2.4 結(jié)果報(bào)告:按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表見附錄B(補(bǔ)充件)報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸菌群的MPN值。5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)48h觀察結(jié)果 bglb產(chǎn)氣情況從右圖可知，濃度梯度1:10、1:100、1:1000每個(gè)梯度的三根管都產(chǎn)氣。最右邊一根為空白管。48h觀察結(jié)果 bglb產(chǎn)氣情況從右圖可知，濃度梯度1:10實(shí)驗(yàn)結(jié)論：查MPN表得，每毫升樣品中大腸桿菌群的MPN值為:mpn 1100實(shí)驗(yàn)結(jié)論：查MPN表得，每毫升樣品中大腸桿菌群的M6 糞大腸菌群測定6.1 用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48士2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。6.2 將所有

16、接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.510.5水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24士2h 水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5 C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽性和陰性對照。6.3 記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽性;不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。6.4 結(jié)果報(bào)告;按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克(毫升)樣品中糞大腸菌4的MP值。6 糞大腸菌群測定24h觀察結(jié)果（EC肉湯產(chǎn)氣情況）濃度梯度為0.10.001的樣品均產(chǎn)氣。24h觀察結(jié)果（EC肉湯產(chǎn)氣情況）濃度梯度為0.10.00結(jié)論： 本次報(bào)告樣品檢測各個(gè)稀釋梯度均產(chǎn)氣。 查MPN表

17、得：每mg樣品中糞大腸桿菌群MPN值1100.結(jié)論：7.大腸桿菌測定7.1 將6. 3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h，取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)(EMB)平板，36士IC培養(yǎng)24士2h,7.2 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。7.3 如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落;如無典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落.用接種針接觸菌落中心部位.移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，36士1培養(yǎng)18-24h,7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。7.4.1一色氨酸肉湯:在36士1培養(yǎng)24士2h后，加Kovacs氏試劑。2-0.3m L，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)

18、陽性反應(yīng)。7.大腸桿菌測定結(jié)論：加Kovacs氏試劑，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。結(jié)論：加Kovacs氏試劑，上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基:在36士1培養(yǎng)48士2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm X1 00mm試管中，加5%。一蔡酚乙醇溶液0.6 mL,40%氫氧化鉀溶液0.2m L和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h，觀察現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：未出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗(yàn)陰性。7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基:在36士1培養(yǎng)48士2h。以將 M R- VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液，觀察現(xiàn)象。 左圖為滴加甲基紅前。試管從做到又分別為空白管、樣品管、

19、陽性管滴加甲基紅后，右圖將 M R- VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅Koser氏枸櫞酸鹽肉湯在36攝氏度培養(yǎng)96h.觀察到到的結(jié)果是：液體澄清、無變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：koser氏枸櫞酸鹽肉湯試驗(yàn)為陰性。Koser氏枸櫞酸鹽肉湯在36攝氏度培養(yǎng)96h.大腸桿菌鑒別結(jié)果靛基質(zhì)MRVP枸櫞酸鹽鑒別（型別）+-典型大腸桿菌大腸桿菌鑒別結(jié)果靛基質(zhì)MRVP枸櫞酸鹽鑒別（型別）+-典7.4. 3 革蘭氏染色:取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌大腸桿菌與金黃色葡萄球菌7.4. 3 革蘭氏染色:取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)

20、二 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)培養(yǎng)基原理:1.馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：馬鈴薯浸出粉有助于各種霉菌的生長；葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。2.孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅培養(yǎng)基）：蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氫鉀為緩沖劑；硫酸鎂提供必須的微量元素；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；氯霉素可抑制細(xì)菌的生長；孟加拉紅作為選擇性抑菌劑可抑制細(xì)菌的生長，并可減緩某些霉菌因生長過快而導(dǎo)致菌落漫延生長。實(shí)驗(yàn)二 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵最適合生長環(huán)境1、酵母菌a、酵母菌能在pH 值為3-7.5 的范圍內(nèi)生長，最適pH 值為pH4.5-5.0 b、最適生長溫度一般在

21、2030之間 c、酵母菌在有氧和無氧的環(huán)境中都能生長，即酵母菌是兼性厭氧菌，在缺氧的情況下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情況下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在時(shí)，酵母菌生長較快。d、適于在含糖量較高的物質(zhì)生長最適合生長環(huán)境1、酵母菌2、霉菌a、大多數(shù)霉菌繁殖最適宜的溫度為2530 b、一般而言，營養(yǎng)豐富的食品其霉菌生長的可能性就大，天然基質(zhì)比人工培養(yǎng)基好。 c、最適水分活度為0.852、霉菌菌落特征：1、酵母菌：濕潤，粘稠，易挑起，表面光華，比細(xì)菌的菌落大而厚 2、霉菌菌落的特征： a、形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或松或緊的形狀。 b、菌落和培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑

22、取，菌落正面與反面的顏色、構(gòu)造，以及邊緣與中心的顏色、構(gòu)造常不一致。 菌落特征：1、酵母菌：濕潤，粘稠，易挑起，表面光華，比細(xì)菌的c、霉菌的菌絲有營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲的分化，而氣生菌絲沒有毛細(xì)管水，故它們的菌落必然與細(xì)菌或酵母菌的不同，較接近放線菌。 c、霉菌的菌絲有營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲的分化，而氣生菌絲沒有毛細(xì)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程5 操作步驟5.1 樣品的稀釋 所用樣品：5.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品至盛有225 mL 滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即為1:10稀釋液?；蚍湃胧⒂?25 mL 無菌蒸餾水的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min，制成1:10 的樣品勻液。5.1.2

23、液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。5.1.3 取1 mL 1:10 稀釋液注入含有9 mL 無菌水的試管中, 另換一支1 mL 無菌吸管反復(fù)吹吸,此液為1:100 稀釋液。5.1.4 按5.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管。5.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2 個(gè)3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液于2 個(gè)無菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1

24、 mL樣品稀釋液加入2 個(gè)無菌平皿作空白對照。5.1.6 及時(shí)將15 mL20 mL 冷卻至46 的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基(可放置于461恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。5 操作步驟5.2 培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板倒置，281培養(yǎng)5d，觀察并記錄。5.3 菌落計(jì)數(shù)肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位（colonyforming units，CFU）表示。選取菌落數(shù)在10 CFU150 CFU 的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個(gè)平板的可記錄為多不可計(jì)。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。5.2 培養(yǎng)

25、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用肉眼觀察各個(gè)稀釋度的平板，未發(fā)現(xiàn)可疑菌落。所以過期奶茶中菌落數(shù)N10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用肉眼觀察各個(gè)稀釋度的平板，未發(fā)現(xiàn)可疑菌落。所以過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，放置一星期奶茶的霉菌和酵母菌菌落總數(shù)小于10，可能是由于奶茶中添加了防腐劑，也可能是取樣的奶茶的含糖量較低，營養(yǎng)物質(zhì)含量低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，放置一星期奶茶的霉菌實(shí)驗(yàn)四 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基原理：1. 10氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、維生素和生長因子；葡萄糖提供碳源；磷酸氫二鉀為緩沖劑；較高含量的氯化鈉提供較高的滲透壓，抑制大多

26、數(shù)非葡萄球菌的微生物；丙酮酸鈉促進(jìn)細(xì)菌生長。2.Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)：胰蛋白胨、牛肉膏浸粉和酵母膏粉提供碳氮源、維生素和生長因子；丙酮酸鈉和甘氨酸刺激葡萄球菌的生長；氯化鋰和亞碲酸鉀抑制非葡萄球菌的微生物；含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黃使菌落產(chǎn)生透明圈，而脂酶作用則產(chǎn)生不透明的沉淀環(huán)；凝固酶陽性的葡萄球菌還能還原亞碲酸鉀而產(chǎn)生黑色菌落；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。 3.營養(yǎng)瓊脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。實(shí)驗(yàn)四 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌操作步驟：1 樣品的稀釋 所使用的樣品：熟雞蛋1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g

27、樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000 r/min均質(zhì)1 min2 min，制成1:10的樣品勻液。1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管，制成1:100 的樣品勻液。1.4 按8.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。操作步驟：1 樣品的稀釋2 接種和培養(yǎng)2.1 每個(gè)稀釋度的樣品（液體樣品可包括原液），分別吸取1 mL 樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個(gè)稀釋度接種3管。2.2同時(shí)做一個(gè)空白對照組。并取一支陽性對照組。2.3將上述接種物，空白對照組及陽性管于36 下培養(yǎng)45h-48h.2 接種和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 1. 樣品稀釋液中前3個(gè)稀釋梯度梯度的試管中均有白色絮狀物。2.用接種環(huán)從有細(xì)菌生長的各管中，移取1環(huán)， 分別接種Baird