藥典附錄課件

1、高效液相色譜法2005版中國(guó)藥典天宇藥業(yè)2007年4月流程高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。洗脫分等度洗脫和梯度洗脫二種。梯度洗脫，可用兩臺(tái)泵或單臺(tái)泵加比例閥實(shí)現(xiàn)程序控制。色譜信息的收集和處理常用積分儀或數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行。適用范圍高效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品的分析測(cè)定，特別是多組分藥品的測(cè)定，雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測(cè)定。有的藥品需在色譜分離前或后經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)方能進(jìn)行分離或檢測(cè)。由于應(yīng)用了各種特性的微粒填料和加壓的

2、液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。儀器組成高效液相色譜儀由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱 反相 非極性填充劑 常用的有C18 C8 氰基柱 氨基柱正相：極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜：離子交換填充劑；分子排阻色譜：凝膠或高分子多孔微球等填充劑手性鍵合填充劑用于對(duì)映異構(gòu)體的拆分分析。色譜柱填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類(lèi)型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測(cè)物的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10A）以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物

3、則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。檢測(cè)器最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器UV其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器（PDAD、PAD、DAD）熒光檢測(cè)器FD電化學(xué)檢測(cè)器ECD示差折光檢測(cè)器RID蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD質(zhì)譜檢測(cè)器等MSD檢測(cè)器紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測(cè)物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電

4、化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度通常并不呈線(xiàn)性關(guān)系，必要時(shí)需對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器是液相色譜中使用最廣泛的檢測(cè)器，幾乎所有的液相色譜儀都配有此類(lèi)檢測(cè)器，是一種選擇性檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器靈敏度高，噪音低，線(xiàn)性范圍寬，對(duì)流速和溫度的波動(dòng)不靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜，但是，紫外檢測(cè)器只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的選擇有一定限制，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)必須小于檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外檢測(cè)器工作原理：朗伯-比爾定律，即當(dāng)一束單色光透過(guò)樣品池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸光度（A）與吸光組分的濃度（C）和樣品池的光

5、徑長(zhǎng)度（L）成正比。分類(lèi)：紫外檢測(cè)器包括固定波長(zhǎng)檢測(cè)器，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和光電二極管陳列檢測(cè)器三類(lèi)。紫外檢測(cè)器可變波長(zhǎng)檢測(cè)器是目前配置最多的檢測(cè)器，光路系統(tǒng)類(lèi)似于分光光度計(jì)，一般采用氘燈或鹵鎢燈為光源，光束經(jīng)單色器分光后按需要組分的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，從而提高靈敏度。有的還具有雙波長(zhǎng)比例檢測(cè)功能，可用于峰純度檢查。二極管陣列檢測(cè)器是一種光學(xué)多通道檢測(cè)器。在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管，每一個(gè)二極管相當(dāng)于一個(gè)單色器出口狹縫，二極管越多分辯率越高，一般是一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上一個(gè)納米譜帶寬的單色光。DAD的工作原理是：復(fù)色光通過(guò)樣品池被組分選擇性吸收后再進(jìn)入單色器，照射在二極管陳列裝置上，

6、使每個(gè)納米波長(zhǎng)的光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號(hào)強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜，從而獲得特定組分的結(jié)構(gòu)信息，有助于未知組分復(fù)雜組分的結(jié)構(gòu)確定。許多色譜工作站可將兩張色譜圖繪在一張三維坐標(biāo)圖上而獲得三維光譜色譜圖，也可進(jìn)行峰純度檢查。以峰純度數(shù)值說(shuō)明某個(gè)色譜峰的純度，數(shù)值越高，色譜峰為單峰的可能性越大；數(shù)值越低，色譜峰為重疊峰的可能性越大，用于指導(dǎo)色譜分離條件的摸索。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，將色譜信息和相對(duì)應(yīng)的光譜信息相結(jié)合，按一定的數(shù)學(xué)模型處理，能解決重疊峰的識(shí)別和定量難題。但DAD檢測(cè)器的靈敏度比通常的UV檢測(cè)器約低一個(gè)數(shù)量級(jí)。所以單純用于含量測(cè)定或雜質(zhì)檢查時(shí)，還是采用UV檢測(cè)器為好。流動(dòng)相 由于C18鏈

7、在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。流動(dòng)相各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類(lèi)型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。但對(duì)某些品種，必須用特定牌號(hào)的填充劑方能滿(mǎn)足分離要求者，可在該品種項(xiàng)下注明。流動(dòng)相的制備用高純度的試劑配制流動(dòng)相，必要時(shí)照紫外光光度法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合規(guī)定，水應(yīng)為

8、新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸餾水。凡規(guī)定PH值的流動(dòng)相，應(yīng)使用精密PH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。配制好的流動(dòng)相應(yīng)通過(guò)適宜的0.45um的濾膜濾過(guò)，用前脫氣。應(yīng)配制足量的流動(dòng)相備用。供試溶液的配制 供試品用規(guī)定的溶劑配制成供試品溶液。定量測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液和供試品溶液均應(yīng)分別配制二份。供試品溶液在注入色譜儀前，一般應(yīng)經(jīng)適宜的0.45um的濾膜濾過(guò)，必要時(shí)，在配制供試品溶液前，樣品需經(jīng)預(yù)凈化，以免對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜分離。色譜柱的理論板數(shù)（n）24在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同

9、，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬（Wh/2）,按n=5.54(tR/ Wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。分離度（R） 2(tR2 tR1) R= - W1 + W2式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬（如 圖）。除另有規(guī)定外，定量分析時(shí)分離度應(yīng)大于1.5。拖尾因子（T） W0.05h T = - 2d1式中 W0.05h 為5%峰高處的峰寬； d1 為峰頂點(diǎn)至峰前沿間的距離除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.951.05之間。峰面積法測(cè)定時(shí)，T值偏離過(guò)大，也會(huì)影響小峰的檢測(cè)和定量的準(zhǔn)確度。含量定量方法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法雜質(zhì)檢查法按藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法測(cè)定雜質(zhì)的含量或限量時(shí)，如雜質(zhì)對(duì)照品已經(jīng)建立，則可按規(guī)定用上述外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定；如雜質(zhì)對(duì)照品沒(méi)有建立，無(wú)法獲得，或雜質(zhì)未知，則可按下法測(cè)定