血漿miRNA-30、miRNA-199、miRNA-208及miRNA-374在ACS診斷中的應(yīng)用研究課件

1、1血漿miRNA-30、miRNA-199、miRNA-208及miRNA-374在ACS診斷中的應(yīng)用研究導(dǎo) 師：王玉明 教授 段 勇 教授研究生：李 勤昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專業(yè)2Company Logo內(nèi)容研究背景1技術(shù)路線2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果3討論和結(jié)論43研究背景急性冠脈綜合征(ACS):是指冠狀動(dòng)脈內(nèi)不穩(wěn)定的粥樣斑塊破裂引起血栓形成，導(dǎo)致的心臟急性缺血綜合征。 指急性心肌缺血引起的一組臨床癥狀，包括： ST段抬高急性心肌梗死（STEMI） 非ST段抬高急性心肌梗死（NSTEMI） 不穩(wěn)定性心絞痛（UA）衛(wèi)生部心血管病防治研究中心，中國(guó)心血管病報(bào)告2013。定義與分類4研究

2、背景高血壓高血脂糖尿病肥胖缺乏運(yùn)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化吸煙冠心病家族史高齡房顫ACS的多種危險(xiǎn)因素5研究背景世界衛(wèi)生報(bào)告指出：心血管病是人類的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是危害人類健康的主要?dú)⑹种?，在全球人類死亡原因中排在第三位，相?dāng)于1700萬(wàn)人/年死于心血管病。預(yù)計(jì)2020年死亡人數(shù)將增加50，達(dá)到2500萬(wàn)人/年，占全球死亡總數(shù)的1/3，在全球人類死亡原因中排名第一位。衛(wèi)生部心血管病防治研究中心，中國(guó)心血管病報(bào)告2013。心血管疾病的流行病學(xué)7研究背景圖-2012年中國(guó)城市居民主要疾病死因構(gòu)成比（%）8研究背景圖-2012年中國(guó)農(nóng)村居民主要疾病死因構(gòu)成比（%）10研究背景圖-2002年2011年城鄉(xiāng)居民急

3、性心肌梗死死亡率變化趨勢(shì)11研究背景目前對(duì)于心肌梗死診斷的主要血清生物學(xué)標(biāo)志物是肌鈣蛋白。肌鈣蛋白自身也存在一定的缺陷： 1、胸痛發(fā)生3h內(nèi)敏感性低； 2、急性心肌梗死以外的其他疾病也會(huì)升高； 3、一些特殊物質(zhì)干擾抗原抗體反應(yīng)導(dǎo)致肌鈣蛋白假性升高； 4、不能很好的區(qū)分不穩(wěn)定性心絞痛和穩(wěn)定性心絞痛。需要尋找更好的生物學(xué)標(biāo)志物。Kartukha A,et al. Clin Chem Lab Med,2009, 37(11/12):1091-1095.傳統(tǒng)標(biāo)志物的不足12研究背景微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)約21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，在動(dòng)植物中均有表達(dá)。m

4、iRNAs通常與靶mRNAs 的3-非編碼區(qū)(3-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNA介紹14研究背景miR-208b可通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺素抑制肌球蛋白重鏈?zhǔn)沟眯募±w維化。miRNA-374b能刺激血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖和遷移，并使這些細(xì)胞形成纖維增殖性病變。miRNA介紹Satoh M, et al. J Journal of cardiac failure, 2010 ,16(5):404-10.Gupta SK,et al. Circ Cardiovasc Genet ,2010, 3:4848.15研究背景研究證實(shí)在急性心肌梗死發(fā)生時(shí)，外周血或血漿中的某些miRNA

5、的表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化。心肌特異性miRNA可能成為一種理想的生物學(xué)標(biāo)志物用于急性心肌梗死的診斷及判斷預(yù)后。 Corsten MF，et alCirc Cardiovasc Genet，2010，3(6)：499506miRNA介紹17技術(shù)路線各組血漿樣本提取miRNA生化檢測(cè)cTnI、CK-MB甲醛變性膠電泳驗(yàn)證熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果比較分析miRNA-30dmiRNA-199amiRNA-208bmiRNA-374b引物18Company Logo實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果血漿RNA的甲醛變性凝膠電泳28S28S28S18S18S18S5S5S5S19Company Logo實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果熒光定量PC

6、R檢測(cè)miRNA表達(dá)量PCR擴(kuò)增的各miRNA引物20實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果各miRNA溫度梯度電泳2170 30s最適退火溫度 30s94 15s40 cycles6595測(cè)熔解曲線95 15min實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果各miRNA的最適退火溫度22實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果50bp 100bpmiRNA-30d的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖、擴(kuò)增曲線及溶解曲線 擴(kuò)增產(chǎn)物分析24實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果25實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果各患者組血漿miRNA的表達(dá)情況miRNA-30dmiRNA-199amiRNA-208bmiRNA-374bmiRNA-199a27實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果miRNA與cTnI的相關(guān)性分析各miRNA表達(dá)倍數(shù)和cTnI檢

7、測(cè)值的相關(guān)性r=0.739r=0.840r=0.879miRNA-30dmiRNA-199amiRNA-208b28實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果診斷心肌梗死的準(zhǔn)確性比較各胸痛時(shí)間段miRNA、cTnI和CK-MB診斷心肌梗死的ROC曲線胸痛3h胸痛36h胸痛612h29實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果診斷心肌梗死的準(zhǔn)確性比較各胸痛時(shí)間段miRNA、cTnI和CK-MB的AUC值30討論和結(jié)論1、國(guó)內(nèi)外對(duì)miRNA -208b與ACS診斷的報(bào)道已有很多，但都是單獨(dú)診斷，且對(duì)miRNA -30d、 miRNA-199a 、miRNA-374b與ACS診斷的報(bào)道還沒(méi)有。2、本文對(duì)四種miRNA與ACS診斷進(jìn)行聯(lián)合分析，并得出很好的

8、結(jié)果。討論31討論和結(jié)論3、本實(shí)驗(yàn)顯示在ACS的不同階段miRNA-30d、miRNA-208b、miRNA-374b的表達(dá)都是上調(diào)的；而miRNA-199a的表達(dá)是下調(diào)的。4、四種miRNA在ACS的不同階段的表達(dá)水平不一致，以在STEMI時(shí)表達(dá)最高，這與大多數(shù)的研究一致。討論32討論和結(jié)論5、miRNA-374b在ACS的不同階段的表達(dá)雖然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是卻不能將STEMI組與NSTEMI組、UA組與SA組進(jìn)行區(qū)分(P0.05)。6、四種miRNA在ACS不同階段的表達(dá)差異：胸痛3h時(shí)只有miRNA-208b的表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；胸痛36h時(shí)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；胸痛612h時(shí)均無(wú)統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義。討論33討論和結(jié)論7、本研究中，血漿miRNA與cTnI具有相關(guān)性，且miRNA在診斷心肌梗死方面優(yōu)于cTnI，這與Yvan等的研究基本相同，但Keller等的研究結(jié)果卻與此相反。8、本研究中， miRNA在胸痛發(fā)作1小時(shí)后的部分患者血漿中也可以檢測(cè)到。討論34討論和結(jié)論1、血漿miRNA與cTnI的相關(guān)性分析表明：miRNA可能是一種新的心肌損傷指標(biāo)，其敏感度較高，可以反映心肌微小損傷。2、血漿miRNA-30d、miRNA-199a、miRNA-208b可能作為ACS早期診斷的生物標(biāo)志物，特別是miRNA-208b，能很好的將ACS的各階段進(jìn)行區(qū)分。結(jié)論35討論和結(jié)論3、血漿miRNA-374b表達(dá)上調(diào)，但是卻不能將將ACS的各階段進(jìn)行區(qū)分，可能miRNA-374b是心肌細(xì)胞特有表達(dá)的一種miRNA。4、四種miRNA，尤其是miRNA-208b，它能準(zhǔn)確的對(duì)急性心肌梗死進(jìn)行診斷，堪比cTnI。結(jié)論36討論和結(jié)論5、血漿miRNA的聯(lián)合運(yùn)用可提高心肌梗死診斷的準(zhǔn)確性，但與cTnI聯(lián)合運(yùn)用效果不大。6、不論單獨(dú)診斷還是聯(lián)合診斷時(shí)都以miRNA-208b表現(xiàn)最佳。結(jié)論37致謝衷心的感謝我的導(dǎo)師王玉明教授三年來(lái)