DNA提取原理和方法課件

1、 DNA extraction ZJL2014.05.09細胞內(nèi)的核酸包括DNA與RNA兩種分子，均與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。真核生物的DNA又有染色體DNA與細胞器DNA之分。前者為雙鏈線性分子；后者為雙鏈環(huán)狀分子。除此之外，在原核生物中還有雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒DNA；在非細胞型病毒顆粒內(nèi)，DNA的存在形式多種多樣。 DNA extraction 極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，鈉鹽比游離核酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。核酸的理化性質(zhì)提取DNA總的原則 :1 保證核酸一級結(jié)構(gòu)

2、的完整性；2 其他生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4 其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取斷裂成為線狀共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料 陰離子交換樹脂 磁珠高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的?；蚪MDNA的提取濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶

3、解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物基因組DNA的提取Approximately 1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube;Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion is not co

4、mplete after 24 hr;Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;Transfer the top aq

5、ueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,00

6、0 rpm for 25 min at 4C;Wash pellet once with 70% ethanol, air dry;Resuspend DNA in ddH2O.Use 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR. Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA1.SDS ：十二烷基硫酸鈉2.Tris：緩沖液3.EDTA 2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and

7、incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;作用：細胞裂解時PH值也能穩(wěn)定作用：a. 溶解細胞膜、核膜上脂質(zhì)成分 b.使蛋白質(zhì)變性 作用：是二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細胞膜的穩(wěn)定性。Tail solution:3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;Proteinase K :作用：廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質(zhì)，將DNA游離。 7.Transfer the top aqueou

8、s phase to a fresh microfuge tube;8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min at RT;9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。Chloroform：10.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3M NaOAc

9、 (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;11.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;NaOAc (pH=6.0) :1. 沉淀核酸，縮短乙醇沉淀的時間2. 提供單價陽離子。減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，100% ethanol任意比和水相混溶，奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。但是加其他比例的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。非基因組DNA的提取堿裂解法密度梯度

10、離心法煮沸法質(zhì)粒DNA的提取1、培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增 -對數(shù)生長后期2、收集和裂解細菌3、質(zhì)粒DNA的純化質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法1、培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增 -對數(shù)生長后期 在含有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細菌(單克隆)，使細菌快速增殖的同時質(zhì)粒DNA得到大量擴增。37oC振蕩過夜質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法2、收集和裂解細菌 非離子型/離子型去污劑 裂解 有機溶劑/堿 加熱 質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法3 、質(zhì)粒DNA的純化 - CsCl-溴化乙錠梯度密度離心 取決于線狀DNA與閉環(huán)DNA與溴化乙錠結(jié)合的量質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為

11、線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用 溶液 Resuspension Buffer 成分：50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖: 增稠。維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。 EDTA : 二價金屬離子的螯合劑，抑制

12、DNase的活性。 有利于溶菌酶的作用。 這一步溶液中還可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。當(dāng)溶液中PH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。 溶液 Lysis Buffer 成分 ：0.2M NaOH / 1% SDS NaOH ：溶解細胞，DNA變性 SDS ： (1)溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。 (2)解聚細胞中的核蛋白。 (3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 SDS與NaOH聯(lián)用：增強NaOH的強堿性 SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用 吸附柱 Spin Column with Collection Tubes結(jié)構(gòu)： 特殊硅基

13、質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過。 高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。 大提&小提 區(qū)別： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特異性去除RNA）、含一定量PEG的氯化物（回收質(zhì)粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利于細菌的裂解和質(zhì)粒的純化，所以大提的產(chǎn)物比小提的量多很多，而且純度很高。 3.小提一般用于質(zhì)粒鑒定和對純度要求不是很高的實驗，大提用于質(zhì)粒的大量提取和轉(zhuǎn)染等純度要求很高的實驗。* 內(nèi)毒素的去除內(nèi)毒性也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性胞膜上一種成分，細菌外膜的外部脂質(zhì)完全由內(nèi)毒素分子組成。包含疏水區(qū)域也包含了親水和帶電區(qū)域，從而賦予其與其它分子相互作用的獨特性質(zhì)。細菌在其活躍生長時表面的內(nèi)毒素成分較少，而一旦其死亡則會釋放大量內(nèi)毒素。在質(zhì)粒提取的裂解過程中，內(nèi)毒素會從細菌的外膜釋放到裂解液中。內(nèi)毒素會對原代細胞的DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生嚴(yán)重影響，同樣也會影響培養(yǎng)細胞的敏感性，內(nèi)毒素水平增加可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的大幅下降。原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分