教學(xué)課件-糖化酶活力測定

1、子情境：酶制劑發(fā)酵產(chǎn)品檢驗(yàn)- 糖化酶活力測定 子情境：酶制劑發(fā)酵產(chǎn)品檢驗(yàn)- 糖化酶活力測定 糖化酶簡介以及其活性的測定原理 糖化酶的應(yīng)用及生產(chǎn) 糖化酶的催化原理 酶活測定方法糖化酶簡介以及其活性的測定原理 糖化酶的應(yīng)用及生產(chǎn) 糖化酶的應(yīng)用與生產(chǎn)糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或-淀粉酶（-amylase），是一種含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在601000kDa 之間。因發(fā)酵工業(yè)中大量用作淀粉糖化劑，習(xí)慣上簡稱糖化酶。 糖化酶的應(yīng)用與生產(chǎn) 糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精和葡萄糖漿的

2、主要酶類。特別是釀酒酵母利用淀粉原料發(fā)酵時(shí)，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因?yàn)榇蠖鄶?shù)釀酒酵母只能利用可發(fā)酵的糖進(jìn)行酒精發(fā)酵。 糖化酶不僅用于酒類、酒精生產(chǎn)和葡萄糖漿的制取，還廣泛地用于抗生素、氨基酸、有機(jī)酸的生產(chǎn)。糖化酶是我國產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的酶制劑之一。糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精和葡萄糖漿的主要酶類。特別目前，工業(yè)中廣泛使用黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米根霉(Rhizopus oryzae)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)為生產(chǎn)菌株來發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶。今天的實(shí)驗(yàn)用酶就

3、是利用黑曲霉變異菌株進(jìn)行液體深層通風(fēng)發(fā)酵后提取獲得。目前，工業(yè)中廣泛使用黑曲霉(Aspergillus nige糖化酶的作用機(jī)制 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端（整個(gè)碳鏈只有一個(gè)還原端，與之相對的都是非還原端）依次水解a- 1,4 糖苷鍵, 切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元，并像- 淀粉酶一樣, 使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成- D- 葡萄糖。對于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時(shí)，它也可以水解a- 1,6 糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 連接的碳鏈，但水解a- 1,4 糖苷鍵的速度最快，它

4、一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。糖化酶的作用機(jī)制 酶活測定方法測定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭愛農(nóng)法（法） 、Schoorl法（法）和對硝基苯酚葡萄糖法（法）、3,5-二硝基水楊酸(DNS) 等方法。 本試驗(yàn)測定糖化酶活力采用次碘酸鈉法。糖化酶以可溶性淀粉為底物在一定條件下（pH范圍是46, 溫度范圍是4060）進(jìn)行反應(yīng)，生成的葡萄糖用次碘酸鈉法定量測定。以單位時(shí)間內(nèi)分解，糖苷鍵生成葡萄糖所需的酶量為酶的活力單位。 酶活測定方法測定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭愛農(nóng)法次碘酸鈉法： 碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性條件下，未與C6H12O6 作

5、用的NaIO可轉(zhuǎn)變成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2 ，便可計(jì)算出未參與反應(yīng)的NaIO ，由此推導(dǎo)出糖化酶催化所產(chǎn)生的C6H12O6 的含量。 1.I2 與 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O2.C6H12O6 與NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI3. C6H12O6反應(yīng)完后,剩余的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng): 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI4.歧化產(chǎn)物在酸性條件下進(jìn)一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O5.析出的I2 可用

6、標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI次碘酸鈉法： 碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能注釋 在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡萄糖與1mol NaIO作用，而1molI2產(chǎn)生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖與1molI2 相當(dāng)。只要得出對照組和實(shí)驗(yàn)組所消耗的硫代硫酸鈉體積，兩者相減就可以得出與葡萄糖反應(yīng)的那部分次碘酸鈉的量，從而可以確定酶解生成的葡萄糖的量，從而計(jì)算出酶活。注釋 在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡萄糖與1mol NaII2NaIONaIO3I2完全歧化反應(yīng)，無葡萄糖I2NaIONaIO另一部分歧化反應(yīng)生成NaIO3NaIO

7、一部分與葡萄糖反應(yīng)I2實(shí)驗(yàn)組對照組I2NaIONaIO3I2完全歧化反應(yīng)，I2NaIONaIO四、操作步驟1. 取7個(gè)帶塞的試管（其中3個(gè)測今年批次的酶活、另外3個(gè)測去年批次的酶活、1個(gè)作空白對照），分別吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸緩沖液2.5ml，混勻后于40 水浴中預(yù)熱10min。2. 加入酶液0.5ml（空白對照組以煮沸失活的酶液代替）于40 ，反應(yīng)10min；反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立即于沸水浴加熱5min使酶失活(此時(shí)應(yīng)將試管的塞子打開）。四、操作步驟3.取上述反應(yīng)液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加堿速度不能過

8、快,否則過量NaIO 來不及氧化C6H12O6 而歧化為不與C6H12O6反應(yīng)的NaIO3 和NaI ,使測定結(jié)果偏低) ，搖勻后在暗處放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉為指示劑（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。記錄0.1N硫代硫酸鈉消耗的毫升數(shù)：酶液樣品（A）、空白對照（B）；3.取上述反應(yīng)液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩5.計(jì)算：(1)在上述條件下，1ml酶液每小時(shí)催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位：酶活力單位（U/ml）=（BA）（N/2） 180.1（8/5）2（60/10） 式中:

9、B空白滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)； A酶液滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)（取3次滴定的平均值）； N硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度。 180.1葡萄糖的摩爾質(zhì)量。 8/5表示從8ml酶反應(yīng)體系取出5ml反應(yīng)液。 2所加酶液為0.5ml，按定義為1ml。 60/10表示酶反應(yīng)時(shí)間為10min，按定義為1h。5.計(jì)算：（2）在上述條件下， 1ml酶液每分鐘催化2%淀粉溶液水解生成1mol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）：酶活力單位（U/ml）=（BA）10-3 （N/2）（8/5）1062 （1/10）式中符號與前式相同，其中： 10-3 ml換算成L。 106 mol換算成mol。（2）

10、在上述條件下， 1ml酶液每分鐘催化2%淀粉溶液水解生方法二：DNS法測定糖化酶活力糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。在煮沸條件下，葡萄糖在堿性介質(zhì)中被3,5-二硝基水楊酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水楊酸被還原成紅褐色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出淀粉經(jīng)糖化酶水解后產(chǎn)生的葡萄糖總量。方法二：DNS法測定糖化酶活力糖化酶有催化淀粉水解的作用，能操作步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7支25mL

11、具塞刻度比色管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長540nm，用0號管調(diào)零點(diǎn)，測出16號管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加教學(xué)課件-糖化酶活力測定2、糖化酶活力測定將糖化酶粉劑或濃縮液稀釋至2040單位/毫升，制成酶制備；取甲、乙兩比色管（50毫升），分別加入2%可溶性淀粉溶液2

12、5ml和0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5ml，搖勻，放入40士0.2的恒溫水浴鍋中水浴5-10分鐘；在甲管中加酶制備液2ml,搖勻，并記錄時(shí)間，反應(yīng)10分鐘后,立即加入20% NaOH溶液0.2毫升,搖勻；將兩管取出冷卻,并于乙管中補(bǔ)加入酶制備液2毫升(作為空白對照) ；取上述反應(yīng)液2毫升放于盛有2毫升3,5一二硝基水楊酸的25毫升比色管 中,按工作曲線的步驟以乙管為空白測其吸光度。由吸光度值從工作曲線上查得葡萄糖的毫克數(shù),再按下面的公式計(jì)算酶活力單位。2、糖化酶活力測定將糖化酶粉劑或濃縮液稀釋至2040單位/ 0-7沸水浴加熱5min，取出、冷卻至室溫，蒸餾水定容至25ml，顛倒混勻，測吸光度

13、以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 0-7沸水浴加熱5min，取出、冷卻至室溫，以吸光度值為糖化酶活性測定過程甲乙加25ml可溶性淀粉（2%）加5ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.1M）40士0.2水浴 5-10min加糖化酶液2ml-40士0.2水浴 10min加0.2mlNaOH（20% ）、冷卻糖化酶活性測定過程甲乙加25ml可溶性淀粉（2%）加糖化酶液糖化酶活力測定過程加糖化酶液2ml-甲乙取上述反應(yīng)液2毫升放于盛有2毫升3,5一二硝基水楊酸的25毫升容量瓶中,按工作曲線的步驟以乙管為空白測其吸光度。由吸光度值從工作曲線上查得葡萄糖的毫克數(shù),再按公式計(jì)算酶活力單位。糖化酶活力測定過程加糖化酶液2ml-甲計(jì)算以1克酶粉劑