蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)研究現(xiàn)狀與方向

1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)研究現(xiàn)狀與方向摘要：蛋白質(zhì)是生物體維持生命活動(dòng)不可或缺的功能性大分子物質(zhì)，解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)于人們了解蛋白質(zhì)的 生物學(xué)功能及其生理特性具有重要意義。近些年來(lái)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)不斷發(fā)展，除了傳統(tǒng)意義上的 X射線晶體衍射法和核磁共振技術(shù)等，具備高分辨率的冷凍電鏡技術(shù)的出現(xiàn)令此領(lǐng)域有了革命性的進(jìn) 步。文章分析及比對(duì)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的作用機(jī)制、技術(shù)進(jìn)展以及它們未來(lái)的研究方向。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；X射線晶體衍射；核磁共振；冷凍電鏡蛋白質(zhì)是生物的生命進(jìn)程中的主要功能性大分 子物質(zhì)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)即利用蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的 解析來(lái)分析蛋白質(zhì)生物學(xué)功能，并進(jìn)一步研究生物 體生命活動(dòng)分子機(jī)制囚

2、。故解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)是日 前較為熱門的研究方向$現(xiàn)階段對(duì)蛋白質(zhì)分子空間 結(jié)構(gòu)的解析方法主要有較為傳統(tǒng)的核磁共振技術(shù) (nuclear magnetic resonance)X 射線晶體衍射法(X- ray crystalline diffraction)以及近期研究較多的冷凍 電鏡技術(shù)(Cryo-Electron Microscopy)2等 $一、X射線晶體衍射法自從1895年倫琴發(fā)現(xiàn)X射線后，物理學(xué)家們就 開始探索X射線的特性及其應(yīng)用方向叫在1934年， 貝爾納和克勞福特得到了第一張蛋白質(zhì)(胃蛋白酶) 晶體的X射線衍射圖片$ 1953年，蛋白質(zhì)晶體學(xué)家 佩魯茨通過將重金屬粒子引入蛋白晶體里

3、，進(jìn)行同 晶置換來(lái)解決蛋白晶體X射線衍射相位問題，提出 了蛋白質(zhì)晶體分子結(jié)構(gòu)可測(cè)定型的理論基礎(chǔ)，并進(jìn) 行了低分辨率的蛋白晶體衍射解構(gòu)凱歷史上，用X 射線晶體衍射法第一個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)并對(duì) 其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋的是布萊克和菲利普斯，他們 分別測(cè)出了溶菌酶的三維空間結(jié)構(gòu)并解釋了其分子 作用機(jī)理叫后期，X射線大多由同步輻射光源產(chǎn)生。X射線衍射法測(cè)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時(shí)，需要先 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化及結(jié)晶$解析蛋白晶體結(jié)構(gòu)所 涉及的X射線波長(zhǎng)約為1A，這是因?yàn)榈鞍拙w結(jié)構(gòu) 中的分子均為規(guī)律性分布，且晶體內(nèi)原子間的距離 與此波長(zhǎng)范圍的數(shù)量級(jí)相同時(shí)$當(dāng)光打到蛋白晶體 上，蛋白晶體內(nèi)每個(gè)原子都產(chǎn)生次生射線相互

4、疊加 且干涉，且形成強(qiáng)X射線衍射成像。其晶體衍射狀況 和晶體自身結(jié)構(gòu)相關(guān)，具備強(qiáng)烈的規(guī)律性及特征性$ 其衍射強(qiáng)度與單位晶胞中的重金屬原子排列周期及 方式等特性相關(guān)，衍射的方向和單位晶胞的大小及 形狀等相關(guān)e$人們利用晶體中衍射位點(diǎn)的間距及排 列分析蛋白晶體結(jié)構(gòu)的排列規(guī)律及方式，并通過計(jì) 算機(jī)輔助計(jì)算，利用衍射強(qiáng)度的不同，分析蛋白空間 結(jié)構(gòu)中單個(gè)原子的坐標(biāo)位點(diǎn)%8，以此解構(gòu)蛋白晶體$二、核磁共振技術(shù)核磁共振包括固相和液相技術(shù)，其最大特點(diǎn)是 液相核磁共振技術(shù)$固相核磁共振技術(shù)主要用于不 可溶蛋白結(jié)構(gòu)，而液相核磁共振技術(shù)的應(yīng)用更為廣 闊，它可以在液相環(huán)境中，在各類如溫度、離子濃度 及pH值等因素接近

5、生理?xiàng)l件情況下，對(duì)蛋白進(jìn)行解 構(gòu)。1978年，核磁共振技術(shù)首次被用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 解析，獲得首個(gè)高分辨率病毒衣殼蛋白三維結(jié)構(gòu)(西 紅柿叢矮病毒淚；在2008年，利用固體核磁共振技 術(shù)輔助電子顯微鏡，科學(xué)家獲得了 ！片層結(jié)構(gòu)的淀 粉樣纖維蛋白的完整結(jié)構(gòu)，此蛋白與阿爾茨海默病 關(guān)聯(lián)緊密，有助于人們對(duì)此病癥分子機(jī)理及診療手 段的研究網(wǎng);核磁共振技術(shù)中取得重要進(jìn)展領(lǐng)域之一 是通過核磁共振技術(shù)無(wú)損獲得細(xì)胞中分子結(jié)構(gòu)信 息，2009年，有研究顯示，核磁共振技術(shù)展示了泛素 在細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子交換速率之差，以及細(xì)胞中蛋白 FKBP12與免疫抑制劑相互作用方式明，令人類社會(huì) 進(jìn)一步了解了分子及原子水平中生物大分子功

6、能 ， 以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系&在應(yīng)用液相核磁共振技術(shù)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究 的過程中，首先需要通過同位素對(duì)蛋白樣品進(jìn)行標(biāo) 記，主要是在培養(yǎng)基中利用15N對(duì)氮源標(biāo)記、利用13C 對(duì)碳源標(biāo)記，用同位素標(biāo)記的碳源或氮源為唯一碳 素或氮素的來(lái)源&通過核磁共振技術(shù)處理后，需要指 認(rèn)核磁共振譜圖上的化學(xué)位移，即得到蛋白結(jié)構(gòu)中 可形成核磁共振記號(hào)的每個(gè)原子化學(xué)位移的數(shù)值& 包括主鏈上及側(cè)鏈上每個(gè)原子的化學(xué)位移&化學(xué)位 移指認(rèn)可通過主鏈試驗(yàn)HNCA、HN （CO）CA等或側(cè) 鏈特殊實(shí)驗(yàn)（HB）CB（CGCD）HD等確認(rèn)$12&。正確選擇 原始結(jié)構(gòu)是后續(xù)步驟的重要基礎(chǔ)，通過一些自動(dòng)化 軟件，如CYANA中的C

7、ANDID軟件包，或ARIA等問, 確認(rèn)NOE約束歸屬而獲得粗糙的蛋白原始折疊空 間構(gòu)像&在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究，獲得其結(jié)構(gòu)約束，進(jìn) 一步通過如 ANSO、SANE、Xplor-NIH 或 CYANA 等 軟件計(jì)算結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)確認(rèn)后最后通過如AMBER、 CHARMM以及INSIGHT等模擬分子動(dòng)力學(xué)的軟件 進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的精修。三、冷凍電鏡技術(shù)冷凍電鏡技術(shù)，即冷凍電子顯微鏡技術(shù)網(wǎng),通過 將樣品迅速冷凍固定于玻璃態(tài)不定型溶液里，用透 射電鏡在低溫條件下顯像，再通過圖形處理及后期 計(jì)算解析樣品空間結(jié)構(gòu)。此法具有樣品無(wú)須結(jié)晶、可 研究的生物分子跨度達(dá)到12個(gè)量級(jí)、所需樣品量 少、樣品分辨率已至（近）原子

8、水平等優(yōu)點(diǎn)，突破了研 究生物大分子的各類難題&近幾年，冷凍電鏡技術(shù)的 長(zhǎng)足發(fā)展一是來(lái)自硬件的更新DDD （Direct electron detector，自接電子檢測(cè)相機(jī)）的出現(xiàn)，DDD 具備高分辨的成像裝備，能直接檢測(cè)電子二是來(lái) 源于圖形圖像處理軟件的進(jìn)步， 可分辨較低分子量 的小分子蛋白和細(xì)胞器，并可對(duì)于樣品漂浮而產(chǎn)生 的偏差進(jìn)行糾正&冷凍電鏡技術(shù)包括了樣品分離純化、 電鏡樣品 的制備、蛋白數(shù)據(jù)搜集及處理等步驟。冷凍電鏡中所 需樣品純度需為90%至95%以上，對(duì)于純化較困難 的蛋白樣品，后期可進(jìn)行軟件數(shù)據(jù)模擬純化以區(qū)別 不同狀態(tài)樣品。制備電鏡樣品時(shí)，通過液氮冷卻的（ 烷將含水樣品速凍，將

9、水分子轉(zhuǎn)為玻璃態(tài)非晶體冰, 樣品懸浮于其中，用于減少電子輻射，保持其天然構(gòu) 像閩。然后通過電鏡進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集，數(shù)據(jù)的收集量 來(lái)源于被測(cè)蛋白樣品的均一性、分辨率、對(duì)稱性及成 像質(zhì)量等，對(duì)于均一性差、分辨率差以及不對(duì)稱分子 通常需要采集大量粒子數(shù)據(jù)，約收集5到15萬(wàn)個(gè)數(shù) 據(jù)才可達(dá)到近原子分辨率&粒子數(shù)據(jù)收集后需要進(jìn) 行進(jìn)一步的處理，首先要先確定粒子的參數(shù)，每個(gè)粒 子圖需確定5類參數(shù)，分別為平移的自由度X和Y （兩個(gè)平面中）、旋轉(zhuǎn)的自由度及?。▋蓚€(gè)離開平面 中）和#（一個(gè)平面中）$切，其中從旋轉(zhuǎn)的自由度獲得 了粒子空間三維數(shù)據(jù)，利用對(duì)位可消除一個(gè)平面中 的自由度,可通過重構(gòu)軟件SPIDER、XMIP

10、P及E- MAN2等的計(jì)算用以確認(rèn)每個(gè)粒子相關(guān)參數(shù)&然后， 根據(jù)K均值聚類等算法進(jìn)行二維分類，用以估算粒 子分布及取向、粒子數(shù)據(jù)質(zhì)量等，二維分類后通過中 心截面原理利用共價(jià)線、RCT等方法重構(gòu)樣品的空 間三維結(jié)構(gòu)，而后進(jìn)行三維分類和模型的精修&三維 分類可確認(rèn)不同粒子的空間取向、空間構(gòu)像及組成 和結(jié)構(gòu)等，而獲取高分辨率空間結(jié)構(gòu)，常用FRE- ALIGN和RELION軟件閩。對(duì)模型進(jìn)行精修時(shí)，可利 用投影匹配的方法進(jìn)行比對(duì)，最終大幅度提高物質(zhì) 空間結(jié)構(gòu)的分辨率&最后通過FSC曲線對(duì)分子結(jié)構(gòu) 的分辨率進(jìn)行評(píng)估，通常分辨率在15A以上，可分辨 蛋白亞基的分界線；分辨率在10A以上可辨認(rèn)二級(jí) 結(jié)構(gòu)密度

11、;分辨率在4A以上可分辨蛋白主鏈；當(dāng)分 辨率在3A左右，即可辨別氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)等四。四、未來(lái)方向發(fā)展蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)對(duì)于蛋白分子的結(jié)構(gòu)、生物學(xué) 功能及其生理特性的了解和應(yīng)用具有重要的意義& 近年來(lái)，多種蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的并行發(fā)展，同樣對(duì) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展發(fā)揮了重要的作用&X射線晶體衍射法較為主流和經(jīng)典，2009年世 界上第一臺(tái)X射線自由電子激光裝置建成刖，自由電 子激光形成的射線是具備短時(shí)間高強(qiáng)度的脈沖，對(duì)不 能結(jié)晶的蛋白結(jié)構(gòu)、超小晶體以及受損晶體可獲得衍 射成像，使人們對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)通過X射線衍射 法的解析方式有了另一種不同且全新的理解，在 RCSB Protein Data Bank

12、中通過X射線晶體衍射法解 析的蛋白結(jié)構(gòu)占比約88%。但依賴于大分子晶體的 制備，對(duì)于許多無(wú)法結(jié)晶的物質(zhì)存在著結(jié)構(gòu)的難度。 利用同步輻射光源解析的主要是靜態(tài)或者微動(dòng)態(tài)蛋 白晶體結(jié)構(gòu)，利用X射線自由電子激光解析的則是 ps甚至fs量級(jí)的蛋白動(dòng)態(tài)空間構(gòu)型四，被認(rèn)為有可能 為生物大分子解構(gòu)方式帶來(lái)大跨步的躍進(jìn)。核磁共振技術(shù)可獲得蛋白的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)， 在20世紀(jì)末期，只有相對(duì)分子質(zhì)量較小(25k)的蛋 白空間結(jié)構(gòu)可通過核磁共振技術(shù)解構(gòu)。后因核磁共 振設(shè)備的不斷更新，以及新的核磁脈沖和蛋白標(biāo)定 技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，核磁共振技術(shù)以及可以解構(gòu)的蛋白已 遠(yuǎn)大于25k,甚至可解構(gòu)超大蛋白，如分子量大小為 幾十萬(wàn)的蛋白空

13、間結(jié)構(gòu)。不光如此，液體核磁共振技 術(shù)更大的優(yōu)越性表現(xiàn)在可解構(gòu)蛋白分子在溶液環(huán)境 中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，它可利用核磁弛豫現(xiàn)象研究原子水 平下的多位點(diǎn)的蛋白動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。在生物體中，蛋白 大多具備功能性，故靜態(tài)空間結(jié)構(gòu)的解構(gòu)往往不能 完全反映蛋白功能性，故蛋白動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的解析是對(duì) 于蛋白生物學(xué)活性研究的關(guān)鍵一環(huán)$近些年核磁共 振技術(shù)發(fā)展到可研究更高分子量的蛋白大分子的動(dòng) 態(tài)結(jié)構(gòu)，如選擇性標(biāo)記或C代樣品制備24，可獲得更 多長(zhǎng)程約束,提高解構(gòu)質(zhì)量,如TROSY(Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，橫弛豫優(yōu)化脈沖) 的出現(xiàn)，可指認(rèn)化學(xué)位移及解析解構(gòu)四。但多測(cè)定

14、的 為分子量較小的大分子類物質(zhì)，可解析的蛋白結(jié)構(gòu) 有限。故核磁共振技術(shù)，特別是液相技術(shù)可研究蛋白 動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及其動(dòng)力學(xué)特性，有其獨(dú)到之處，雖 然如此，但由很多實(shí)驗(yàn)技術(shù)還不夠成熟，不具備普適 性，還需要繼續(xù)分析和改進(jìn)$最近發(fā)展迅猛的冷凍電鏡技術(shù)，可測(cè)定非晶體 生物大分子類物資，通過冷凍電鏡技術(shù)可利用其高 分辨率能觀察到小分子物質(zhì)、解析小分子蛋白以及 不對(duì)稱樣品等。冷凍電鏡對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的 發(fā)展在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域做出重要貢獻(xiàn)。20世紀(jì)末，因冷凍電 鏡對(duì)生物對(duì)稱性樣品特有的高度解析性，張景強(qiáng)得 到了分辨率僅為0.8nm的家蠶質(zhì)多角體病毒，在病 毒蛋白結(jié)構(gòu)研究及針對(duì)病毒致病機(jī)制對(duì)應(yīng)藥物研制 方面功不可沒四;清華大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在2016年第一 次利用冷凍電鏡獲取了線粒體中呼吸鏈超級(jí)復(fù)合蛋 白空間結(jié)構(gòu)，指明了以其為靶向物質(zhì)藥物的研究方 向；中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所李國(guó)紅和朱平研究 組合作獲得了 30nm染色質(zhì)左手雙螺旋高分辨率三 維結(jié)構(gòu)，有助人類對(duì)癌癥等病癥分子機(jī)制研究，并 為人類基因組計(jì)劃做出了重要貢獻(xiàn)$同時(shí)冷凍電鏡 技術(shù)伴隨著人類社會(huì)對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重視而 逐漸發(fā)展起來(lái)，清華大學(xué)王宏偉研究組于2017年首 次提出且利用冷凍電鏡成像理論新方法過焦成像技 術(shù)得到高分辨蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)(30)$ 2018年浙江大學(xué) 冷凍電鏡中心首次解析了蛋白質(zhì)原