線粒體自噬探針的研究進展

1、線粒體自噬探針的研究進展摘 要:線粒體自噬(Mitophagy)是細胞自我降解調(diào)節(jié)功能失調(diào)的細胞器，并通過溶酶體進行營 養(yǎng)循環(huán)的過程.線粒體作為組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)必不可少的能量發(fā)生器以及程序性凋亡和壞死細胞死亡的 通道，其核心功能使得線粒體的質(zhì)量和數(shù)量需受到嚴格控制.線粒體自噬在細胞代謝和調(diào)節(jié)生理機 能中起到著至關重要的作用，因此檢測線粒體自噬的方法有著非常重要的研究價值.熒光探針是檢 測線粒體自噬的主要方法之一，該文主要綜述了近些年對線粒體自噬探針的研究進展，旨在為相關 領域的研究提供參考.關鍵詞：線粒體；線粒體自噬；熒光探針；熒光成像線粒體是人體內(nèi)一種特別的細胞器.真核細胞在其中進行氧化和能量轉(zhuǎn)換

2、,其具有自身的遺傳物質(zhì)和體 系，但是由于具有的基因數(shù)量少,所以是一種半自主的細胞器一方面，線粒體是能量轉(zhuǎn)換的工廠和基礎； 另一方面,線粒體代謝過程中所產(chǎn)生的活性氧的數(shù)量也會間接地導致細胞的死亡.所以為了維持體內(nèi)線粒體 的數(shù)量，受毀壞或不必要的線粒體應被及時的消滅M .大量研究發(fā)現(xiàn)，細胞主要經(jīng)由自噬機制選擇性的消 除不需要以及無效的線粒體，這個進程被稱之為線粒體自噬(Mitochondrial autophagy或Mitophagy)血.線粒 體自噬指在活性氧、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化出現(xiàn)損傷,損傷線 粒體被包裹進自噬體中并與溶酶體融合，從而完成線粒體的降解

3、，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.此過程可用圖 1表示.圖1線粒體發(fā)生自噬示意圖1自噬過程涉及生理學，化學等多種交叉學科，檢測線粒體自噬對于腫瘤的預防和治療有十分重要的參考 價值，近幾年也有科學實驗表明，適當加快線粒體自噬可以減少腦中風的危害囪，因此對于線粒體自噬的檢 測一直都是研究自噬領域的熱門.線粒體自噬探針（a-h）誘導自噬的過程中細胞在0 min （ a和e） 30 min （b和f） 90 min（ c和g）和120 min（ d和h）的熒光共聚集圖像；（i）探針1的結(jié)構(gòu)式；（j）（a-h）誘導自噬的過程中細胞在0 min （ a和e） 30 min （b和f） 90 min（ c和g）和12

4、0 min（ d和h）的熒光共聚集圖像；（i）探針1的結(jié)構(gòu)式；（j）探針1在含1.0%DMSO不同pH值溶 液中熒光光譜圖（pH=3.0； 3.4; 4.0; 4.6; 5.0; 5.4; 5.8； 6.0; 6. 8;7.0;7.4和8.0） ; （ k）熒光強度對數(shù)與pH之間的線性關系圖2探針CyPVH#結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及細胞成像17l.l 基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機制探針分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Intramolecular Charge Transfer，ICT）原理是電子給體或電子受體本身充當識別基團的 一部分區(qū).當識別基團和待測物結(jié)合后，作為識別基團的供電子部分或拉電子部分的推拉電子能力發(fā)生改 變，使得

5、體系中，電子發(fā)生重排，從而導致吸收光譜、發(fā)射光譜發(fā)生變化，表現(xiàn)為光譜發(fā)生紅移或藍移.Tang*團隊成功地設計和合成了一個基于分子內(nèi) 電荷轉(zhuǎn)移（ICT）機制的近紅外（Near Infrared，NIR）熒光 探針Cy-NH2，檢測活細胞的自噬過程,探針可以選擇 性的聚集在線粒體上（圖2）.在生理條件（pH值約 7. 4）作用下，基于ICT效應，電子從伯胺轉(zhuǎn)移到染料 上,NIR熒光消失，探針只顯示綠色熒光.在酸性條件 下，伯胺被酸化，ICT過程被破壞，NIR熒光恢復，探針 的綠色熒光消失，所以在線粒體自噬過程中，線粒體被 溶酶體融合形成自溶酶體,探針被質(zhì)子化，ICT過程被 破壞，在639 nm處激

6、發(fā)狀態(tài)下表現(xiàn)出較強的近紅外熒 光，其綠色熒光消失.Cy-NH2實現(xiàn)了活細胞自噬過程的實時成像.將 MCF-7（ Michigan Cancer Foundation-7，一 種人乳腺癌細 胞株）細胞與Cy-NH2在37 C下孵育30 min，用PBS洗 滌以除去殘留的探針，在無血清培養(yǎng)基中記錄熒光實 時圖像.隨著時間的延長,紅色通道的熒光強度越來越 強;綠色通道的熒光變?nèi)酰@意味著探針在自噬過程中 被質(zhì)子化，認為此探針可以檢測細胞自噬過程.因此 Cy-NH2是一種能對自噬進程進行高選擇性和高靈敏 度成像的熒光探針.其課題組還測定了不同pH條件下 探針的熒光強度，對熒光強度對數(shù)與pH值之間進行了

7、線性擬合=0. 99,標明二者之間有很好的相關性.扭曲分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移（Twisted Intramolecular Charge Transfer,TICT） l8，是ICT中一種特殊的形式，通常 發(fā)生在具有共軛體系的熒光分子中，且含有推-拉電子基團，推電子基團與熒光基團通過可以旋轉(zhuǎn)的單鍵相 連;當熒光團被激發(fā)，由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移,導致原來與芳環(huán)共平面的電子給體繞著單鍵旋轉(zhuǎn)，而與芳環(huán)平面 處于正交狀態(tài)，原來的共軛系統(tǒng)被破壞，部分電荷轉(zhuǎn)移變成完全的電子轉(zhuǎn)移,形成了 TICT激發(fā)狀態(tài),原有的 ICT形式的熒光消失.不發(fā)射或者發(fā)射弱的長波熒光是TICT的特點.Lil3課題組設計了一種探針NI-VIS

8、,它是一種近紅外探針，因此具有背景熒光低以及穿透度高的優(yōu)點.此探針通過黏度相關的熒光變化來對線粒體進行檢測， 同時是一種基于TICT機理設計的探針.探針NINIS通過喹琳基團和苯基通過共軛連接基 連接，在低黏度條件下高速旋轉(zhuǎn)，導致熒光猝滅，在高黏 度條件下可以抑制旋轉(zhuǎn)，恢復其熒光.季銨鹽基團帶來 水溶性的特性，有助于與線粒體的共定位.此外，大的共 軛結(jié)構(gòu)和強的電子推送-拉力使探針具有近紅外發(fā)射特 性，從而產(chǎn)生較高的穿透深度和較低的背景熒光.因為 其測量受到黏度的影響，此課題組檢測了不同黏度條件 下的強度和選擇性(如圖3)，數(shù)據(jù)表明此探針具有良好 的靈敏度，選擇性和線粒體靶向能力.Che/)課題

9、組設計并合成一種新的熒光探針CM- BHNBD(圖4)，可以檢測線粒體酸度.探針基于扭曲分 子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，響應pH值的變化,它們的線性范圍覆蓋 較寬的pH值(2.00 -7.00) 11.兩種探針還具有出色的 膜通透性，良好的光穩(wěn)定性和很低的細胞毒性.營養(yǎng)剝奪會破壞線粒體并導致線粒體自噬.在線粒 體中，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)作為其信號 分子邸，發(fā)揮著至關重要的作用，但是超過限定值的 ROS會損害包括線粒體在內(nèi)的各種細胞器21，在刺激狀 態(tài)下，氧化應激可能促進線粒體吞噬或細胞凋亡.其中探 針CM9BHNBD用于HeLa細胞的OSS模型中以評估線粒 體的p

10、H.用CM-BHNBD( 3.0 M)和線粒體標記物(Mito Tracker Red，MTR)預處理細胞OSS模型，然后通過共聚 焦顯微鏡獲取熒光圖像，根據(jù)細胞熒光強度的分布，發(fā)現(xiàn) 線粒體呈現(xiàn)出非均質(zhì)的酸化.使用CM-BHNBD和MTR在 HeLa細胞中進行了共定位分析(圖5)，結(jié)果表明，探針 CM-BHNBD可用于線粒體自噬過程可視化.通過CM-BHNBD對細胞成像，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)線粒體 酸化至pH值小于7.0,有些線粒體pH值降至5.0以 下;還有一些線粒體甚至被酸化至pH值為3.92，顯示 出比簡單的氧化應激或饑餓模型更高的酸化程度.實 驗還觀察到的酸度與受損的線粒體被酸性自溶酶體包 裹的

11、事實;結(jié)果還表明，在氧化脅迫下，營養(yǎng)缺乏的細 胞中可以觀察到線粒體進一步酸化.基于TICT機理設計的探針具有優(yōu)異的選擇性、靈 敏度和響應性，可以用于細胞線粒體自噬系統(tǒng)過程高 靈敏成像.1. 3 基于AIE發(fā)光機理設計的熒光探針(a)探針 NI-VIS 的化學結(jié)構(gòu)式；(b) Mito-Tracker Green( A) 和NI-VIS( B)的細胞熒光共聚焦成像；(c) NI-VIS在不同黏度的 溶液中的熒光發(fā)射光譜；(6) NI-VIS在不同黏度溶液中的熒光 壽命光譜圖3探針NI-VIS的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)檢測13(a)探針CM擊HNBD的化學結(jié)構(gòu)式；(b)探針CM(a)探針 NI-VIS 的化學結(jié)

12、構(gòu)式；(b) Mito-Tracker Green( A) 和NI-VIS( B)的細胞熒光共聚焦成像；(c) NI-VIS在不同黏度的 溶液中的熒光發(fā)射光譜；(6) NI-VIS在不同黏度溶液中的熒光 壽命光譜圖3探針NI-VIS的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)檢測13(a)探針CM擊HNBD的化學結(jié)構(gòu)式；(b)探針CM擊HN-BD對HeLa細胞熒光成像圖4探針CMTHNBD的結(jié)構(gòu)及其細胞熒光成像19(a)未經(jīng)預處理的Hela細胞在暗視野中的圖像；(b)圖像a 的細胞明場圖；(c)用探針CM-BHNBD和MTR預處理的細胞在 515 nm激發(fā)下的熒光圖像；(6)在4, nm激發(fā)下細胞的熒光圖 像；(e) c和

13、6的疊加圖像；(f) e圖中白框區(qū)域的放大圖像.色帶 代表在各種pH值下的顏色變化圖5 探針CM-BHNBD和MTR在Hela細胞OSS 模型中測定線粒體pH19張衛(wèi)杰博士也因此設計并合成了一種基于AIE 發(fā)光機理的熒光探針TPE-Py-NCS. TPE-Py-NCS既有能 和線粒體膜相結(jié)合的正電荷也有與線粒體蛋白氨基發(fā) 生反應的NCS基團,所以在細胞內(nèi)，此探針可以與負膜 電位的線粒體通過電吸引特性結(jié)合并形成化學鍵牢固 的結(jié)合在線粒體上.用該探針和溶酶體標記物LTR (Lysosomal Marker Red)同時染色細胞，顯現(xiàn)出標記黃 色的線粒體和紅色標記的溶酶體，兩種顏色在自噬過 程中會持

14、續(xù)發(fā)生變化，線粒體標記的區(qū)域的紅色顏色 會在掃描時明顯發(fā)生強度下降,慢慢會與綠色標記的 溶酶體區(qū)域重疊，最終會模糊不清(圖6 b所示).此觀(a)探針TPE-Py-NCS(a)探針TPE-Py-NCS的化學結(jié)構(gòu)式；(b) HeLa細胞探針 TPE-Py-NCS和溶酶體標記物LTR同時染色，記錄線粒體自噬發(fā) 生過程圖6探針TPE-PyP%CS的結(jié)構(gòu)及其對線粒體自噬 的檢測26Wang”課題組設計了治療型探針TPA3,此探針基于聚集誘導發(fā)射機制設計，可以在發(fā)生自噬時動態(tài) 地追蹤線粒體(圖7a).此外.首次在共聚焦顯微鏡下對線粒體和溶酶體有關的線粒體動態(tài)過程進行了原位 監(jiān)測，提供了一種實時系統(tǒng)監(jiān)測方

15、法.一旦功能異常的線粒體通過吞噬作用形成自噬體， 擔任“清道夫”的溶酶體就開始通過融合和遷移清除受 損和老化的線粒體，從而完成線粒體吞噬過程因 此，將探針和溶酶體標記物同時作用于細胞，進行細胞 共定位成像，隨著LED光照射時間的增加，黃色熒光的 區(qū)域(溶酶體標記物的綠色熒光和TPA3染色的紅色熒 光的重合區(qū)域)逐漸增加，由圖7所示，表明自噬體和溶 酶體逐漸融合.結(jié)果進一步證明了探針TPA3能夠示蹤 早期線粒體細胞凋亡,并且追蹤線粒體自噬過程.(a)探針TPA3的化學結(jié)構(gòu)式及其聚集機理；(b) TPA3與脂 質(zhì)體及脂質(zhì)體在水溶液中的掃描電鏡圖像；(c)用不同的LED光 曝光時間對LTR和TPA3

16、染色的HeLa細胞的共定位成像圖圖7探針TPA3的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)27Chen14課題組將AIE的聚集態(tài)發(fā)光特性與Ir( III) 配合物發(fā)磷光特點結(jié)合在一起，設計了一系列探針，該 組探針在高聚合狀態(tài)下熒光強度會增強,具有良好的光 穩(wěn)定性、對線粒體優(yōu)異靶向性，可用于線粒體成像示蹤 (圖8).探針采用具有螺旋槳狀的給電子結(jié)構(gòu)的三苯胺 (TPA)基團咨，該結(jié)構(gòu)帶來AIE特征;結(jié)合苯基咪唑- 菲咯琳衍生物銥(III)絡合物逆.(a)探針TPA3的化學結(jié)構(gòu)式及其聚集機理；(b) TPA3與脂 質(zhì)體及脂質(zhì)體在水溶液中的掃描電鏡圖像；(c)用不同的LED光 曝光時間對LTR和TPA3染色的HeLa細胞的共定位成

17、像圖圖7探針TPA3的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)27五環(huán)金屬銥(III)配合物(IR1-IR5)表現(xiàn)出AIE特性，這些Ir( III)配合物被用作具有良好光穩(wěn)定性的線 粒體探針.在低濃度(500 nM)的短成像時間段(8 min)中，線粒體生理范圍內(nèi)沒有磷光強度波動,Ir1Ar5選 擇性且有效地定位了線粒體.細胞攝取實驗的結(jié)果表明，這些Ir( III)配合物通過非內(nèi)吞性主動轉(zhuǎn)運方法穿 過細胞膜.其中探針 Ir1 和 LTG( Lyso Tracker Green) 一 起成功地監(jiān)測了 CCCP( Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 誘導的線粒體.(a) Ir1-

18、Ir5配合物的化學結(jié)構(gòu)式；(b) Ir1-Ir5的共焦光圖像;(c)二甲基亞颯-(a) Ir1-Ir5配合物的化學結(jié)構(gòu)式；(b) Ir1-Ir5的共焦光圖像;(c)二甲基亞颯-聚對苯二甲酸丁二醇酯(DMSO-PBS)混合物中Ir1的發(fā)射光譜圖8 Ir1-Ir5配合物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)14AIE材料的引入大大改善了熒光分子濃度使用受 限帶來的熒光度下降的缺點.良好的光穩(wěn)定性也為長期 觀察自噬提供了可能性，但是在活體檢測時還需考慮諸 多因素，做進一步改良.1.4 基于ESIPT機理設計的熒光探針當探針分子受光激發(fā)后，發(fā)生在激發(fā)態(tài)分子內(nèi)部鄰近的質(zhì)子給體與質(zhì)子受體之間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應M，此現(xiàn)象稱為激發(fā)態(tài)分子內(nèi)

19、質(zhì)子轉(zhuǎn)移(Excitedrtate Intramolecular Proton Transfer，ESIPT).同時金屬離子可以經(jīng)由不同的信號傳導間接或直接的影響自噬，反 過來，自噬也會影響細胞中金屬離子的含量.金屬離子以信號分子的形式分布在各個信號通路中，從而直 接或間接地參與生命細胞的各種活動，其中就包括細胞的自噬,也可以通過不同的信號啟動細胞的自噬. 例如人體內(nèi)含有豐富的金屬離子Mg2+，因為其存在于線粒體中，所以它可以間接的影響細胞的代謝功 能;濃度較高的Fe3 +也會引起細胞的氧化，加快活性氧的細胞死亡，導致細胞發(fā)生自噬；細胞也會根據(jù)體 內(nèi)Ca2s的含量發(fā)生一系列的激活和停止自噬的活

20、動.因此，可以基于上述原理開發(fā)對金屬物質(zhì)敏感的熒 光探針.圖9熒光探針HHQ的結(jié)構(gòu)式31如鄭曼麗博士合成了一種Mg2+敏感的有機小分子熒光探針8-g 基喹琳衍生物圖9熒光探針HHQ的結(jié)構(gòu)式31因為Mg2 +大量存在于線粒體中,HHQ可以對線粒體自噬過程利用熒 光顯微鏡進行實時的監(jiān)測成像，還能監(jiān)測自噬體與溶酶體融合的過程.當 檢測時，探針以劫持蛋白的方式進入自噬體,其高選擇性會實時定位線粒 體,實現(xiàn)可視化的檢測和追蹤.當探針工作時，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移,阻止探針發(fā)光，當線粒體發(fā)生自 噬時,其釋放的大量Mg2+配位形成熒光配合物HHQ-Mg2+,ESIPT被阻斷后發(fā)射出藍色熒光，自噬體和溶酶

21、體融合伴隨著自噬逐漸結(jié)束，導致HHQ-Mg2 +在pH$5下分解，熒光消失.因為金屬探針本身毒性會大大加快細胞的死亡,導致自噬的發(fā)生,這就會對熒光探針檢測成像產(chǎn)生很大 的干擾.此探針細胞存活率大于90%，毒性較小，幾乎不會對細胞本身的代謝產(chǎn)生影響,不會干擾熒光成像, 有很好的利用價值.基于ESIPT機理設計的金屬離子的探針靈敏度高、成本低、便于進行實時檢測.但對元素選擇性差，檢測 過程中可能也會對其他元素也產(chǎn)生響應，因此排除其他金屬的干擾是此類熒光探針的研究熱點.1.5 同時檢測線粒體和溶酶體的探針現(xiàn)有技術(shù)中，檢測線粒體自噬的探針可能需要同時使用兩種不同的熒光染料分別對線粒體和溶酶體進 行染色

22、來對自噬過程進行監(jiān)測，而且溶酶體參與細胞本身的吞噬作用,細胞內(nèi)吞作用和自噬過程,溶酶體探(a) HQO(a) HQO的化學結(jié)構(gòu)式；(b)在無血清培養(yǎng)基中與HQO孵育 的細胞的實時共聚焦成像圖10 HQO的結(jié)構(gòu)及其細胞成像32HQO32-3 ( 2,6-Bi ( 23,3-dimethyl-1 -propylindo- lin-2-ylidene) ethylidene) -cyclohexanone)是上官棣華 課題組設計出的一種熒光探針(圖10)，克服了監(jiān)測 活細胞中線粒體自噬過程中需要兩種染料的缺點。 HQO 在 559 nm 激發(fā)激光的條件下，可以準確地定位 所測定的線粒體.當受損的線粒

23、體和溶酶體結(jié)合的時 候，由于新產(chǎn)生的自噬溶酶體使得pH值降低，HQO質(zhì)子化，從而分子的激發(fā)波長發(fā)生紅移,可以在635 nm710 nm激發(fā)下定位在自噬溶酶體.當用此探針監(jiān)測線粒體自噬時,HQO會將線粒體與溶酶體染色,并顯示出紅色的熒光，并在接下來的觀測中紅色區(qū)域逐漸變 小，這就表明細胞發(fā)生損傷和死亡，并完成了自噬過程如圖所示.因此,hqo可以用于檢測細胞中的線粒體 自噬.（a） CyT檢測到的線粒體自噬示意圖；（b）小鼠模型中CyT的體內(nèi)熒光圖像圖11 CyT在細胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)的熒光檢測34Chen組利用近紅外探針同時監(jiān)測溶 酶體和線粒體，這是基于自噬過程中pH敏 感的氨基葡萄糖修飾的近紅外花

24、青染料探 針CyT（圖11）.由于線粒體和自噬溶酶體的 pH值不同，該探針可以同時研究活細胞中 的線粒體和自噬溶酶體.在檢測過程中，CyT （a） CyT檢測到的線粒體自噬示意圖；（b）小鼠模型中CyT的體內(nèi)熒光圖像圖11 CyT在細胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)的熒光檢測34程中，當溶酶體溶解受損線粒體演變?yōu)樽允扇苊阁w時,CyT轉(zhuǎn)化為CyTH，并在647 激發(fā)下顯示出強熒光. 因此,CyT可用于同時檢測腫瘤細胞中的線粒體和自噬溶酶體.此外，由于引入了氨基葡萄糖基團，該熒光探 針也成功地應用于腫瘤靶向成像.647 nm長波長發(fā)射還可以實現(xiàn)活體熒光成像.但是因為HQO和CyT探針沒有帶正電荷，導致線粒體的靶向性不特異，體外實驗還需要添加表面活性劑（SDS）.Targeted groupRotor moiety .* 二.:Viscosity-inducedH,NRotatableFluorescence OFFconformational changePlanar（a） Targeted groupRotor moiety .* 二.:Viscosity-inducedH,NRotatableFluores