TIMP4基因的克隆、原核表達(dá)及活性測定

1、TIMP-4基因的克隆、原核表達(dá)及活性測定【摘要】目的:采用RT-PR法獲取TIP-4基因，并通過原核表達(dá)獲取具有生物活性的TIP-4交融蛋白。方法:從SD大鼠心肌組織中提取總RNA，利用RT-PR法擴(kuò)增出TIP-4基因，經(jīng)基因序列分析后構(gòu)建表達(dá)載體PET-28a(+)-TIP-4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)TIP-4的表達(dá)。利用N2+-NTA純化和復(fù)性后，根據(jù)其骨肉瘤細(xì)胞遷移才能的影響檢測其活性。結(jié)果:克隆到編碼序列完全正確的大鼠TIP-4基因，能在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物占全菌總蛋白的23.5%，N2+-NTA純化和復(fù)性后，純度達(dá)90%以上。純化后的交融蛋白使骨肉瘤細(xì)胞株的

2、遷移才能得到顯著抑制。結(jié)論:通過基因克隆和原核表達(dá)的方式可以大量獲得具有生物活性的TIP-4交融蛋白。【關(guān)鍵詞】TIP-4基因克隆基因表達(dá)免疫活性Abstrat:bjetive:TextratthegenefTIP-4ithRT-PRethdsandbtainthebiativeratTIP-4fusinprtEinexpressedinE.li.ethds:TtalRNAasextratedfrardiauslefSDrat.TIP-4geneasbtainedandaplifiedithRT-PRethd.Theislatedfragentassequened,rebinedithplas

3、idpET-28a(+)atERIandHindsitesandtransfredintE.liells.TheexpressinfTIP-4asinduedbyIPTG.TIP-4prteinaspurifiedandrenaturalizedbyN2+-NTA.Theapabilityfinhibitingigratinfstesaraelllineasusedasaeasuretassayitsviability.Results:TheTIP-4geneftherat,hihaslnedandrretlyded,uldbehighlyexpressedintheE.listrain.Th

4、eexpressedprdutftheTIP-4auntedfr23.5%fthettalbaterialprtein.TheTIP-4auntedfratleast90%afterN2+-NTApurifiatin.ThepurifiedTIP-4prteinuldsignifiantlyinhibittheigratinfstesaraellline.nlusin:TIP-4fusinprteinithbiativityanbebtainedprfuselybygenelningandexpressininE.li.Keyrds:TIP-4;genelne;expressin;viabil

5、ityassay目前對惡性腫瘤的治療尚缺乏非常有效的措施，其主要原因在于腫瘤具有侵襲、轉(zhuǎn)移和基因變異等特性，對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的研究成為腫瘤治療的關(guān)鍵。組織基質(zhì)構(gòu)造的破壞和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移得以實(shí)現(xiàn)的先決條件?；|(zhì)金屬蛋白酶atrixetallprteinase，P為一類蛋白水解酶家族，它能降解多種膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白等血管基膜和基質(zhì)構(gòu)造，為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造適宜的環(huán)境。金屬蛋白酶組織抑制劑tissueinhibitrfatrixetallprteinase，TIP的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究上的一大打破，它是P的天然抑制劑，目前根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序分別稱為TIP14。國內(nèi)

6、外對于TIP-4的功能已經(jīng)有了一些研究，但結(jié)果有所差異。Jiang等1的研究發(fā)現(xiàn)，TIP-4可以抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡，而更多的實(shí)驗(yàn)說明TIP-4為腫瘤生長的抑制因素2，3。為進(jìn)一步開展對TIP-4在骨肉瘤和軟骨肉瘤方面的作用及其機(jī)制的研究，以及對其在其他領(lǐng)域的功能，本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)的基因克壟表達(dá)和純化等手段，力求獲取具有生物活性的TIP-4交融蛋白，為以后的研究打下基矗1資料和方法1.1材料1.1.1組織來源：成熟SD大鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。1.1.2菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞：大腸桿菌TG1、BL21(DE3)、pBluesriptSK(+)質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)均由第二軍

7、醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供。骨肉瘤細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生化研究所。1.1.3試劑：RNA抽提試劑盒為上海化舜生物工程產(chǎn)品。RT-PR試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。PyrbestDNA聚合酶為Takara公司產(chǎn)品。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為BI公司產(chǎn)品。質(zhì)粒抽提和膠回收試劑盒為Vigene公司產(chǎn)品。異丙基-D-硫代半乳糖苷酶IPTG為上海生工公司產(chǎn)品。Ni2+-NTA柱為Siga公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1RT-PR1.2.1.1總RNA的提?。喝〕墒霺D大鼠心肌組織約150g，參考薩姆布魯克等4方法及RNA抽提試劑盒手冊，電動勻漿后行總RNA的提齲1.2.1.2DNA的合成

8、：參考RT-PR試劑盒實(shí)驗(yàn)手冊進(jìn)展。RNA(1g/l)2.0l，dNTPs(5dNTP)2.0l，lig-dT引物10unit/l1.0l，RNase抑制劑10unit1.0l，逆轉(zhuǎn)錄酶4unit1.0l，無RNase水加至20l。37溫育60in，然后90溫育5in使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。-20保存。1.2.1.3PR擴(kuò)增：參考GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列及表達(dá)載體pET-28a(+)多克隆位點(diǎn)、應(yīng)用DNAstar軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成。上游引物：5TGGAATTATGTGGGAGT3ERI下游引物：5GAAAGTTGATATTGGTATG3HindIII取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

9、物2.0l為模板，按常規(guī)PR反響條件，先將樣品于94變性5in，參加2.5u的PyrbestDNA聚合酶，按以下參數(shù)循環(huán)35次：94變性1in，58退火1in，72延伸40s，最后一個循環(huán)后，72延伸10in，4保存。1.2.3載體的構(gòu)建及DNA序列分析：將RT-PR產(chǎn)物平端與用ER酶切過的pBSK(+)質(zhì)粒，回收后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，挑白斑培養(yǎng)抽提質(zhì)粒并進(jìn)展初步酶切鑒定，選擇3株酶切合格質(zhì)粒送生工公司測序。把測序正確的質(zhì)粒用ERI和Hind雙酶切，膠回收后與預(yù)先經(jīng)ERI和Hind雙酶切的表達(dá)載體pET-28a(+)在連接酶作用下相連接，構(gòu)建T7啟動子控制下的TIP-4表達(dá)質(zhì)粒見圖1。將pET

10、-28a(+)-TIP-4表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。1.2.4重組克隆的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和復(fù)性及鑒別：將pET-28a(+)-TIP-4表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，接種單菌落至3lLB培養(yǎng)液中37培養(yǎng)過夜，按2%的比例轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液中含50g/l的卡那霉素，37培養(yǎng)至A600條件下為0.61.0，參加IPTG終濃度為1/L，誘導(dǎo)35h，離心搜集菌體，進(jìn)展SDS蛋白電泳，薄層掃描檢測TIP-4的表達(dá)情況。誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎后，搜集包涵體，用洗滌緩沖液洗滌，500l菌液制備的包涵體溶于20l溶解緩沖液。溶解后的蛋白用結(jié)合緩沖液透析24h后進(jìn)展純化。由于TIP-4的N端交

11、融了6His，所以表達(dá)產(chǎn)物以Ni2+-NTA樹脂來純化。溶解的蛋白上預(yù)先以3倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡的Ni2+-NTA柱后，先以10倍結(jié)合緩沖液洗滌，再分別以10倍柱體積的NTA-PH6.5Buffer和NTA-PH5.80Buffer洗脫雜蛋白。直接在Ni2+-NTA柱上復(fù)性5。先用10倍柱體積的復(fù)性緩沖液A洗滌，再用15倍柱體積的復(fù)性緩沖液B洗滌。最后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。純化的TIP-4經(jīng)蛋白質(zhì)濃度測定后，-70保存。esternblt分析鑒別：用10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)展SDS電泳(每孔加TIP-4純化交融蛋白20l)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，切取條帶后在4條件下以的TIP-4單

12、克隆抗體(1:100Siga)孵育24h，漂洗后以帶有辣根過氧化物酶的二抗37孵育30in，4-氯-1-萘酚Siga顯色。1.2.5實(shí)驗(yàn)操作方法：質(zhì)粒抽提、酶切反響、DNA片段回收、連接反響、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、SDS電泳等實(shí)驗(yàn)操作均參照文獻(xiàn)4略加修改良行。1.2.6TIP-4蛋白對骨肉瘤細(xì)胞侵襲性影響的測定(微孔遷移技術(shù))：Byden小室的構(gòu)建參照hyeldinA等6方法。用DE制備濃度為2105個/l的骨肉瘤細(xì)胞懸液，分成兩組：1組為對照組，另1組含濃度為20g/l的TIP-4蛋白，向小室中各參加細(xì)胞懸液100l，37孵育24h后將小室置于4%中性甲醛中固定20in，存在于微孔濾膜上面的細(xì)胞用棉簽蘸

13、95%乙醇輕輕擦去，侵襲至膜下的細(xì)胞用蘇木精和5%結(jié)晶紫染色，膜枯燥后用剪刀將膜剪開，置于玻片上中性樹膠封片并計(jì)數(shù)，每張膜取上、下、左、右、中5個視野，取均數(shù)，每種處理分別重復(fù)3次。取穿過膜的細(xì)胞相對數(shù)作為衡量細(xì)胞侵襲才能的指標(biāo)，計(jì)算方法為：侵襲力=1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用t檢驗(yàn)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1TIP-4基因的獲得新生4dSD大鼠心肌細(xì)胞組織總RNA，經(jīng)甲醛變性電泳，紫外檢測儀下可見完好的28s，18srRNA，說明提取的總RNA質(zhì)量可靠，未出現(xiàn)降解。RT-PR擴(kuò)增得到大小約680bp的特異條帶，大小與預(yù)測結(jié)果一致見圖2。回收此片段平端

14、克隆入載體pBSK(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1，挑取重組子，經(jīng)ERI和Hind雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳見圖3，說明插入片段大小與預(yù)測大小一致。對重組質(zhì)粒中插入片段測序，結(jié)果說明別離的TIP-4基因序列與GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列一致。2.2TIP-4的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及復(fù)性采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，在分子量約23kD處有顯著的蛋白表達(dá)條帶，該蛋白大小與理論計(jì)算值根本一致，凝膠自動掃描分析顯示，其占BL21細(xì)菌總蛋白的23.5%，根本是以包涵體形式存在。將大量誘導(dǎo)的BL21細(xì)菌超聲破碎、洗滌、溶解、純化、復(fù)性后，經(jīng)SDS電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析，除TIP-4特異條帶外，根本無

15、其他條帶，薄層掃描結(jié)果可見純度達(dá)90%以上，詳見圖4、圖5。經(jīng)過esternblt分析后顯示所獲得的蛋白質(zhì)與TIP-4抗體具有特異性作用，為TIP-4蛋白見圖6。2.3TIP-4的活性測定atrigel經(jīng)過重建后在聚碳酸酯膜外表形成類似天然基底膜構(gòu)造，對其的侵襲才能可以顯示出腫瘤細(xì)胞的侵襲力。本研究中顯示，TIP-4交融蛋白使骨肉瘤細(xì)胞侵入基底膜才能受到明顯影響，浸入的細(xì)胞數(shù)為61.35.2對照組為80.57.6，其抑制率到達(dá)25.1%(見表1)。3討論TIP-4是1996年JhnGreene等7采用已表達(dá)序列標(biāo)志(expressedsequenetag，EST)序列測定的方法研究P的抑制物T

16、IP時(shí)發(fā)現(xiàn)的，屬于TIP家族成員中的一員，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序而被命名為TIP-4。后來通過免疫組化、Nrthen-Blt，RT-PR及原位雜交等方法來研究發(fā)現(xiàn)，TIP-4的組織表達(dá)相當(dāng)局限，在腎臟、胰腺、結(jié)腸及直腸中的表達(dá)量非常低，在肝臟、腦、肺、甲狀腺、小腸等組織中根本無表達(dá)，但在心臟有大量的轉(zhuǎn)錄和翻譯。鑒于此，我們選擇用成熟SD大鼠的心肌細(xì)胞作為基因的組織來源，參考GeneBank(gi:48255910)發(fā)表的序列，應(yīng)用DNAstar生物軟件設(shè)計(jì)引物，用RT-PR方法別離到了TIP-4目的基因，經(jīng)序列測定顯示別離得到的TIP-4目的基因與文獻(xiàn)報(bào)道一致。這意味著在SD大鼠的心肌細(xì)胞中確實(shí)有

17、TIP-4RNA表達(dá)，并且該研究中所采用的引物設(shè)計(jì)正確且條件適宜。研究中把別離到的目的基因克隆至pET-28a(+)表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21為宿主菌進(jìn)展表達(dá)，發(fā)如今BL21中TIP-4的表達(dá)量可占全菌總蛋白的23.5%，且根本上是以包涵體的形式存在。由于TIP-4的N端交融了6His，所以表達(dá)產(chǎn)物在溶解后采用N2+-NTA柱來純化。本研究中采用直接在N2+-NTA柱上進(jìn)展復(fù)性，使傳統(tǒng)的透析復(fù)性、稀釋復(fù)性等方法存在的效率低、損失量大的缺點(diǎn)得到了很大的克制。用獲得的TIP-4蛋白參加培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，TIP-4蛋白對骨肉瘤的侵襲力產(chǎn)生了較大的影響，抑制率到達(dá)25.1%，這意味著所獲得的TIP-4蛋

18、白具有抑制骨肉瘤侵襲才能的生物學(xué)活性，從而為后續(xù)的TIP-4的構(gòu)造和功能研究提供了基矗【參考文獻(xiàn)】1蔣曉山,黃信孚,李吉友,等.金屬蛋白酶組織抑制物與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系J.中華外科雜志,2000,38(4):291-293.2FisherKE,PpA,Kh,etal.Turellinvasinfllagenatriesrequiresrdinatelipidagnist-induedG-prtEinandebrane-typeatrixetallprteinase-1-dependentsignalingJ.laner,2022,5(12):69.3aJ,hiarelli,KzarekarP,etal.ebranetype1-atrixetallprteinaseprteshuanprstateanerinvasinandetastasisJ.ThrbHaest,2022,93(4):770-778.4薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主編.金冬雁,黎孟楓主譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.北京:科學(xué)出版社,1999:16-87.5FrankenKL,HiestraHS,vaneijgaardenKE,etal.Puri-fiatinfhis-taggedprteinsbyibilizedhelateaffin-ityhratgraphy: