科研實驗轉化為微生物學綜合教學實驗的探索與實踐

1、科研實驗轉化為微生物學綜合教學實驗的探索與實踐摘 要】將科研實驗“納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產維生素K2”轉化為微生物學綜合教學實驗。利用響應曲面設計不同的培養(yǎng) 基，通過對納豆芽胞桿菌的種子和發(fā)酵培養(yǎng)制備維生素K2產品，結合提取與液相分析技術探討不同營養(yǎng)組分對維生素K2的產量的 影響，優(yōu)化其發(fā)酵工藝。通過該綜合實驗融合前期微生物學、生物化學、分析化學的基礎實驗，讓學生系統(tǒng)掌握微生物制備營養(yǎng)化學 品的流程與方法，培養(yǎng)學生科研和創(chuàng)新思維，提高學生分析和解決生物工程領域實際問題的能力，為其未來升學和工作奠定基礎。【關鍵詞】科研實驗;微生物學；綜合教學實驗；維生素K2;芽胞桿菌；發(fā)酵微生物學課程是生物工程、制

2、藥工程、生物技術等專業(yè)培養(yǎng) 方案中一門重要的專業(yè)基礎課,是一門實踐性、技術性很強的課 程，因此，微生物實驗是全面掌握該課程的重要環(huán)節(jié)口。通過微 生物實驗的學習，需要訓練學生掌握微生物最基本的操作技能， 并進一步深化微生物學的基本理論，培養(yǎng)學生通過觀察和試驗 進行思考、分析問題和解決問題的能力。為強化微生物實驗的 教學效果,需加強微生物實驗涉及生物學知識的深度和廣度，提 高學生的創(chuàng)新和動手能力。目前，多個高校在微生物基礎實驗的基礎上加強創(chuàng)新性綜 合實驗的投入和實施效果，結合各高校的學科特色和研究方 向，改造和創(chuàng)新新型的綜合實驗內容，提高學生實驗技能，培養(yǎng) 科研熱情時。我校生物工程和制藥工程專業(yè)首

3、批入選國家一 流本科專業(yè)，生物化工學科是國家重點學科和教育部國家特色 重點學科,近年來，在本科微生物實驗教學中，積極推進綜合實 驗進入科研實驗室，鼓勵科研教師開發(fā)設計新型綜合實驗并引 入教學，通過融合個人科研工作建立一批從科研工作中衍生的 創(chuàng)新性學生綜合實驗皿。微生物制備生物化學品是微生物現(xiàn) 有應用中一個重要的分支，也是我校生物化工學科的特色研究 方向，但是當前微生物教學中典型產品案例少，很多學生在學 習之后僅知道利用酵母發(fā)酵生產啤酒或面包這種非常常規(guī)和 傳統(tǒng)的案例，因此可在微生物實驗教學中融入多種微生物制備 經典生物化學品的案例，擴大學生的知識面，增強學生對生物 技術行業(yè)的了解,l2,o本文

4、選取科研項目“納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產維生素K2”中較 為成熟的部分，將其開發(fā)為微生物學的綜合性實驗，作為一個具 有代表性和綜合性的實驗，應用于本科生微生物學的綜合實驗 教學中。該實驗涵蓋培養(yǎng)基的配置、微生物培養(yǎng)、發(fā)酵過程指標 監(jiān)控、產物提取與檢測等實驗環(huán)節(jié)，能夠讓學生融合前期學習的 微生物學、生物化學、分析化學等學科的基礎實驗，全面了解基 于微生物開發(fā)生物化學品的流程，體現(xiàn)了綜合實驗“綜合”的特 性。另外，該實驗中通過分組設置不同發(fā)酵條件并研究最終產 量差異，更利于培養(yǎng)學生分析實驗結果、思考問題的能力，啟發(fā) 學生科研和創(chuàng)新思維。1綜合教學實驗設計的相關背景維生素K2是一類脂溶性凝血類維生素，為甲

5、萘醌類系列 化合物，在骨質疏松癥的預防和治療方面具有顯著的效果，被 稱為“第四代抗骨質疏松產品”。據報告，維生素K2具有抗動 脈鈣化和骨關節(jié)炎、抗腫瘤、延緩衰老、修復損傷細胞等功效廣 泛地應用于醫(yī)藥、食品等領域。其安全性已得到中國食品藥品 監(jiān)督管理局、美國藥品研究所及歐洲議會和歐盟理事會的權威 認定。目前,維生素K2的來源主要分為三種從食物中攝 取或由腸道微生物合成；（2）化學合成；（3）微生物發(fā)酵。但是， 食物中維生素K2的含量極少，化學合成法又存在前體原料來 源限制，產生大量異構體，活性和產率低，污染環(huán)境等缺陷，微 生物發(fā)酵法具有條件溫和、可大規(guī)模生產、制備的維生素K2生 物相容性高和活性

6、高等優(yōu)點，被認為是最具潛力的生產方法， 但目前仍存在維生素K2產量低等問題，限制了其工業(yè)化生 產|l3,o為了提高維生素K2的產量，本試驗主要采用響應面優(yōu)化 的方法探究不同培養(yǎng)基對維生素K2產量的影響。該綜合實驗 將作為生物化學品開發(fā)領域的一個實驗案例，以芽孢桿菌的培 養(yǎng)和維生素類化學品的開發(fā)為模板，融合產品開發(fā)的不同環(huán) 節(jié),鞏固微生物學、生物化學、分析化學等學科的基本實驗知識 和技能，進一步強化生物工程、制藥工程專業(yè)本科生的實驗設 計和理論聯(lián)系實際的能力。2綜合教學實驗的設計本課題通過培養(yǎng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產營養(yǎng)化學品維生素 K2,以提高維生素K2的產量為目的，在實驗過程中探索不同的 碳源、

7、氮源、無機鹽等因素的最優(yōu)配比，采用響應面優(yōu)化培養(yǎng)基 來提高菌種維生素K2的產量。響應曲面設計方法是利用合理 的試驗設計方法并通過實驗得到一定數(shù)據，采用多元二次回歸 方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的 分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。 本實驗利用響應曲面設計方法設計了 13種發(fā)酵培養(yǎng)基，通過測 定不同培養(yǎng)基條件下細胞密度OD值、PH值、甘油含量、維生素 K2含量的變化并繪制出曲線，根據數(shù)據對比獲得最合適的培養(yǎng) 條件。納豆芽抱桿菌菌種活化 一發(fā)酵培養(yǎng) 一產物提取產物分析細胞密度細胞形態(tài)發(fā)酵液pH甘油濃度萃取VK2產量分光光度計光學顯微鏡 pH計 滴定法旋轉

8、蒸發(fā)HPL基析$OD600形態(tài)圖片pH值濃度g/L濃度g/L濃度g/L圖1實驗流程圖2.1實驗目的（1）以維生素K2產品為例了解基于微生物培養(yǎng)制備生物化 學品的原理和方法，掌握產品開發(fā)過程的微生物培養(yǎng)、發(fā)酵過程 控制、產物提取、產物分析各個環(huán)節(jié)的關鍵點。（2）了解利用響應面設計多因素多水平實驗的方法,掌握培 養(yǎng)基配置、微生物無菌操作、分光光度法測定細胞生物量、滴定 法檢測甘油濃度、高效液相色譜檢測VK2等基本操作方法。（3）培養(yǎng)學生綜合應用前期所學基礎實驗完成連續(xù)性綜合 實驗的能力，激發(fā)學生科研熱情，提高學生分析問題、解決問題 的能力141o（4）探究納豆芽孢桿菌產維生素K2的最佳培養(yǎng)條件，為

9、產 量提升提供指導。2.2實驗原料與儀器實驗試劑：牛肉膏（生化試劑，上海凌峰化學試劑有限公 司）、大豆蛋白胨（生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司）、酵母 粉（生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司），甘油（分析純、國藥 集團化學試劑有限公司）,葡萄糖（分析純、國藥集團化學試劑有 限公司）、磷酸氫二鉀（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）、氯 化鈉（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）、葡萄糖（分析純，國 藥集團化學試劑有限公司）、氯化鈣（分析純，汕頭市西隴化工廠 有限公司）、七水合硫酸鎂（分析純，上海美興化工股份有限公 司）、酚酞（分析純,上海美興化工股份有限公司）、異丙醇（分析 純，國藥集團化學試劑

10、有限公司）、正己烷（分析純，南京萬隆實 業(yè)有限公司）、氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、 高碘酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。實驗儀器:意大利BEL電子分析天平、雙人凈化工作臺、恒 溫振蕩搖床、立式壓力蒸汽滅菌器、雙目生物顯微鏡、Perkins Elmer 紫外/可見分光光度計、高速臺式離心機、生物傳感分析儀、 旋轉蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、Dionex高效液相色譜。2.3實驗內容2.3.1納豆芽池桿菌的培養(yǎng)與發(fā)酵（ 1 ）配置培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖3%，pH 7.0-7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油5%，大豆蛋

11、白胨 3%，酵母粉0.06%，磷酸氫二鉀0.03%，氯化鈣0.01%，七水合硫 酸鎂0.03%o響應面法設計的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下表所示，其余 組分相同。表1響應面設計的13種培養(yǎng)基編號甘油g/L大豆蛋白胨g/LIJHPO3HOg/L140306.75280306.753401006.754801006.75540650.393680650.3937406513.18806513.1960300.39310601000.39311603013.1126010013.11360656.75按照上述配比配置種子和發(fā)酵培養(yǎng)基，每50ml分裝于250ml的搖瓶中，包扎,121C滅菌30mino（2）種子

12、的活化將低溫保藏的納豆芽孢桿菌菌種（Bacillus subtilis natto）接 入裝有含50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，紗布封口，培養(yǎng) 溫度37C ,轉速120rpm,搖床培養(yǎng)16小時;按照5%的接種量接 種至新鮮種子培養(yǎng)基中，同樣條件下活化第二代,獲得種子液。（3）發(fā)酵培養(yǎng)取活化好的二代種子液2ml分別接種到裝有含50ml發(fā)酵培 養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，培養(yǎng)溫度37C，轉速200rpm,培養(yǎng) 72h,在發(fā)酵過程中按照間隔時間取樣，檢測發(fā)酵過程中的各項 指標,至發(fā)酵結束后，從搖床中拿出。2.3.2發(fā)酵過程指標的監(jiān)控（1）微生物形態(tài)監(jiān)控每隔12h取樣，制片，采用Leica

13、DM1000顯微鏡拍攝不同發(fā) 酵條件及不同時間下納豆芽孢桿菌的形態(tài)。（2）OD值測定OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。每隔 24h取樣,以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，測定一次OD600值, OD的范圍在0.20.8之間。（3）底物消耗測定取2mL發(fā)酵液于12000rpm下離心5min,移1mL上清液于 250mL錐形瓶中，加蒸餾水10mL,加兩滴酚酞試劑，用0.05mol/L 的NaOH標準液滴定至變色，記錄NaOH用量V1。然后加入 10mL0.1mol/L高碘酸鈉溶液,避光反應5min，再加入乙二醇（體 積分數(shù)25%）5mL,避光反應5mino然后用NaOH標準液滴定至 變

14、色，記錄NaOH用量V2。甘油含量計算:用質量百分數(shù)表示：甘油含量（%）=92.1XcX（V2-V1）/mX100%其中：c表示所用氫氧化鈉標準溶液的濃度;m表示試樣的質量2.3.3產物的提取與分析維生素K2的提取:將10mL發(fā)酵液移入250mL帶擋板的錐 形瓶中，向發(fā)酵液中加入異丙醇和正己烷（1 : 2 : 4）,在搖床上 210rpm振蕩30min，靜置分層后，取上清旋蒸，記錄產物的質量， 冷凝下來的正己烷回收。將所得的產物用異丙醇洗出，定容到 10mL的棕色容量瓶中。維生素K2的液相色譜檢測:液相條件：C18柱、流動相： 100%甲醇、流速：1.0mL/min、進樣量：30以、柱溫：50

15、T、波長： 270nm 響。2.4實驗數(shù)據與結果（1）通過響應面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的研究，我們獲得了不同培 養(yǎng)基條件下的維生素K2產量（如圖），其中最優(yōu)培養(yǎng)基為12號培 養(yǎng)基，其維生素K2產量達道31.18mg/ L,較優(yōu)化之前提高了 114.59%，該培養(yǎng)基組分為：甘油60g/L，大豆蛋白胨100g/L， K2HPO4-3H2O 13.1g/L。（2）提供的碳源越多，其消耗速率越快，在獲得充足碳氮源 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌，其生物量不斷上升，最大值達 成的原理，通過實驗方案的設計和具體操作培養(yǎng)學生動手實踐 能力，通過實驗現(xiàn)象的捕捉和數(shù)據分析提高學生對實驗結果的 解析能力，有助于激發(fā)學生的科

16、研熱情,培養(yǎng)創(chuàng)新意識|l6,o該綜合實驗是連續(xù)性實驗，前序實驗的成敗決定后續(xù)試驗 是否順利進行，尤其是實驗中涉及到無菌操作、旋蒸和液相色譜 分析等操作，在教學過程中需要注意:（1）無菌操作決定微生物 實驗的成敗,尤其是在微生物接種、取樣等操作過程中，需要嚴 格控制無菌；（2）產物提取過程需要用到旋轉蒸發(fā)，在操作中需 要注意抽真空加熱等操作（3）液相分析過程中，注意樣品的預 處理以及流動相的配置和預處理，避免出現(xiàn)堵塞色譜柱的現(xiàn)象；（4）建議實驗分組進行，不同條件各分配2人一組，設置平行樣 本，進行培養(yǎng)基的配置接種等操作，過程指標的檢測和分析，可 以分別取樣，一同分析，提高效率。2.5思考與討論（1）在不同的培養(yǎng)基組成中，氮豐富和氮限制的培養(yǎng)條件下 VK2的產量發(fā)生了哪些變化？（2）納豆芽孢桿菌的細胞形態(tài)在